[發明專利]一種體內檢測ROP蛋白活性的方法

在審

• 申請號: 202110904455.6
• 申請日: 2021-08-06
• 公開（公告）號: CN113789343A
• 公開（公告）日: 2021-12-14
• 發明（設計）人: 吳巨友;張皓;劉雪瑩;曹鵬;張明亮;王鵬;張紹鈴;謝智華;齊開杰
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12N15/66;C12N15/56;C12N15/29;A01H5/12;A01H6/82;C12Q1/34;G01N21/64
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;李曉峰

本發明公開了一種體內檢測ROP蛋白活性的方法，包括(1)構建融合蛋白表達載體并轉化農桿菌感受態細胞；(2)植物葉片注射；(3)植物活體成像儀定性檢測熒光強度；(4)酶標儀定量檢測熒光素酶活性：使用酶標儀進行熒光掃描，以顯示熒火素酶分解底物后產生熒光的強度來判斷熒光素酶活性的強弱，從而檢測目標蛋白AtROP1的活性強弱的程度。該方法基于RIC1作為ROP蛋白的下游效應子能特異地與活性形式的ROP結合這一特點，通過熒火素酶互補實驗，借助煙草瞬時表達系統，利用植物活體成像儀和酶標儀進行定性定量檢測熒光強度，從而實現體內檢測ROP蛋白的活性。同時該方法還具有高靈敏度、可視化、可定量化和操作簡單高效等特點。

技術領域

本發明涉及生物工程技術領域，尤其涉及一種體內檢測ROP蛋白活性的方法及其應用。

背景技術

小G蛋白(small GTPase)存在于多種真核生物中，是多個信號轉導途徑的中樞調節因子。在結構上小G蛋白被分為5個家族，包括Ras、Rho、Rab、Ran和Arf。其中Rab、Arf主要調控胞內囊泡運輸，Ran調控核質運輸，而Ras和Rho蛋白起信號分子的作用。動物和真菌中Rho蛋白可分為Cdc42、Rac等亞家族，而植物中僅存在一類特有的Rho家族成員，被命名為ROP(Rho-related GTPase from plants)，由于ROP與動物的Rac蛋白序列相似，所以也被稱為RAC。擬南芥基因組編碼11個ROP基因，分為4組：第Ⅰ組(ROP8)、第Ⅱ組(ROP9-ROP11)、第Ⅲ組(ROP7)、第Ⅳ組(ROP1-ROP6)。ROP1調控擬南芥花粉管頂端生長。ROP2調控根毛頂端生長，促進鋪板細胞凸起區域形成；ROP4和ROP6引起根毛去極性生長。ROP10和ROP11負調控ABA反應，包括氣孔的關閉、種子的萌發和根的伸長等。Molendijik等人還發現過量表達持續激活型的GFP-CA-rop4和GFP-CA-rop6可以使根毛去極性生長，并使微絲束伸入到根毛頂端部位。擬南芥持續激活型突變體CA-rop2植株根毛頂端會形成密集的微絲網絡，而在持續非激活型突變體DN-rop2根毛中頂端的細小微絲會被縱向排列的微絲束代替。這些研究結果都表明不同的ROP成員具有不同的生理功能，并且參與調控眾多細胞學過程。

ROP是細胞中重要的分子開關，可以在GDP結合的非活性形式與GTP結合的活性形式之間不斷轉換。ROP活性的上游的調控因子，包括鳥苷酸交換因子(guanine nucleotideexchange factor,GEF)、GTP酶激活蛋白(GTPase-activating protein,GAP)和鳥苷酸解離抑制因子(Guanine nucleotide dissociation inhibitor,GDI)。其中GEF促進ROP由非活性態轉變為活性態，從而激活ROP及其下游的信號轉導途徑。GAP促進GTP的水解，使ROP變成與GDP結合的非活性形式。GDI抑制非活性ROP轉變為活性形式，并將非活性的ROP隔離于胞質中。而RIC(ROP-interactive CRIB motif containing protein)是ROP蛋白重要的下游效應子，包含一個保守的CRIB(Cdc/Rac-interactive binding)結構。在擬南芥的基因組中編碼了11個RICs。目前關于RIC的研究主要集中在花粉管、鋪板細胞和根細胞。在花粉管中，ROP1通過兩個相互拮抗的下游途徑相互制約對花粉管的生長進行調控：激活RIC4來促進花粉管頂端的微細微絲的聚合，同時又激活RIC3提高頂端Ca²⁺濃度進而促進頂端微細微絲的解聚。在鋪板細胞中與花粉管類似，但相對復雜一點的兩個相互拮抗的途徑調節了鋪板細胞的嵌合生長：ROP2/4激活RIC4促進微絲的聚合，進而促進凸起區(lobe)的形成和發育；同時ROP2/4使RIC1失活，將RIC1的活性限制在凹陷區(neck)。凹陷區的RIC1被ROP6激活，造成微管排列成橫向有序列陣來抑制該區的側向擴張；另一方面，RIC1介導的凹陷區的橫向微管又抑制了ROP2/4-RIC4信號途徑。此外，Lin等還發現RIC1作為SPK-ROP6的下游效應子，調控根細胞中ROP信號途徑介導的對生長素極性的運輸。因此，說明ROP蛋白與上游調控因子和下游效應子之間相互作用共同構成了一系列信號傳遞網絡。