[發明專利]一種體內檢測ROP蛋白活性的方法

在審

• 申請號: 202110904455.6
• 申請日: 2021-08-06
• 公開（公告）號: CN113789343A
• 公開（公告）日: 2021-12-14
• 發明（設計）人: 吳巨友;張皓;劉雪瑩;曹鵬;張明亮;王鵬;張紹鈴;謝智華;齊開杰
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12N15/66;C12N15/56;C12N15/29;A01H5/12;A01H6/82;C12Q1/34;G01N21/64
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;李曉峰

1.一種體內檢測ROP蛋白活性的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：

(1)構建融合蛋白表達載體并轉化農桿菌感受態細胞：克隆目標基因AtROP1和AtRIC1，將AtROP1、AtRIC1依次分別與雙酶切的載體pCAMBIA1300-NLuc、pCAMBIA1300-CLuc進行連接，獲得含有目標基因的重組質粒AtROP1-pNL和AtRIC1-pCL；將構建好的重組質粒分別轉化到農桿菌感受態細胞并進行抗生素篩選獲得含有目標基因重組質粒AtROP1-pNL和AtRIC1-pCL的農桿菌菌株；

(2)植物葉片注射：挑取含有目標基因重組質粒AtROP1-pNL和AtRIC1-pCL的農桿菌菌株分別在含50μg/mL卡那霉素和50μg/mL利福平的液體LB培養基中振蕩過夜培養至OD₆₀₀＝0.3～0.4，收集菌體并用MES緩沖液重懸菌體，調OD₆₀₀＝1.0時放置于搖床上孵育后得侵染液，將含有目標基因表達載體AtROP1-pNL和AtRIC1-pCL的侵染液按體積比1:1混合，然后將混合的菌液注射至待測植物葉片背面的位置，最后將植物進行培養40～48小時；

(3)植物活體成像儀定性檢測熒光強度：選取注射完農桿菌40～48小時后的植物葉片，用含1mmol/L熒火素底物D-luciferin的反應液噴濕葉片背面，將噴濕的葉片在黑暗中靜置后，將其背面向上置于培養皿中，移入植物活體成像系統中檢測發光情況；如果有熒光,即說明激活態的AtROP1可以與AtRIC1存在互作，同時也說明該方法可以檢測到AtROP1蛋白的活性；

(4)酶標儀定量檢測熒光素酶活性：選取注射農桿菌40～48小時后的植物葉片，使用酶標儀進行熒光掃描，根據掃描的數值繪制柱形圖，以顯示熒火素酶分解底物后產生熒光的強度來判斷熒光素酶活性的強弱，從而檢測目標蛋白AtROP1的活性強弱的程度。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的目標基因AtROP1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述的目標基因AtRIC1的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

含有目標基因的重組質粒的構建過程為：

以擬南芥花朵cDNA為模板，設計正反向引物進行PCR擴增，從而將AtROP1和AtRIC1基因克隆；將AtRIC1擴增產物與用BamHⅠ和KpnⅠ雙酶切載體pCAMBIA1300-CLuc進行連接獲得重組載體AtRIC1-pCL；將AtROP1擴增產物與用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切載體pCAMBIA1300-NLuc進行連接獲得重組載體AtROP1-pNL；所設計的正反向引物序列為：

AtRIC1-F：gcgtcccggggcggtaccATGGCGACGACAATGAAG

AtRIC1-R：agtccatttgttggatccGATAATATCGTTACAGGTTGTATCA

AtROP1-F：ctcggtacccggggatccATGAGCGCTTCGAGGTTCGT

AtROP1-R：gtacgagatctggtcgacTAGAATGGAGCATGCCTTCTGC。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有目標基因重組質粒AtROP1-pNL和AtRIC1-pCL的農桿菌菌株的構建過程為：利用熱擊法將含有目標基因的重組質粒AtROP1-pNL和AtRIC1-pCL分別轉化到農桿菌感受態GV3101得到含有目標基因的農桿菌；

所述熱擊法將重組質粒轉化到農桿菌感受態GV3101的步驟如下：

a.取冰浴上融化的農桿菌感受態GV3101細胞，加入表達載體質粒，混勻冰浴后，直接放置液氮中速凍；

b.37℃熱激后快速將管轉移到冰浴中；

c.向離心管中加入無菌不含抗生素的LB培養基，混勻后置于28℃，200rpm/分鐘培養2～3小時；

d.6000rpm離心棄掉上清，回流LB培養基，懸浮沉淀菌體，用涂布棒均勻的涂布在含有50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的固體培養基上，倒置平板在28℃培養箱中過夜培養1～2天；篩選陽性克隆，并進行PCR鑒定得到含有目標基因的農桿菌的陽性菌液，在其中加入50％甘油，于-80℃保存。