[發明專利]一種人畜共患寄生蟲多重PCR檢測方法

在審

• 申請號: 202110903484.0
• 申請日: 2021-08-06
• 公開（公告）號: CN113604581A
• 公開（公告）日: 2021-11-05
• 發明（設計）人: 戴建軍;孫玲偉;張德福;陳旭;吳彩鳳;徐皆歡;張樹山
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 西安碩大知識產權代理事務所(普通合伙) 61283
• 代理人: 楊哲

本申請公開了一種人畜共患寄生蟲多重PCR檢測方法，包括從動物血液中和糞便中分別獲取DNA；將獲得的血液DNA和糞便DNA，分別制備成濃度為25ng/μL的DNA溶液，并將兩者的DNA溶液混合，混合后按照10倍倍比稀釋成若干個濃度梯度；對獲得的若干濃度梯度的DNA溶液進行多重PCR擴增；利用瓊脂糖凝膠電泳觀察，以不出現明顯條帶的前一個濃度為最低檢測濃度，并對最低檢測濃度及以上濃度的擴增溶液，進行DNA結構和功能的分析，進而判斷出寄生蟲的種類。本方案，具有較高的實用性且方便快捷，使臨床上檢測人畜共患寄生蟲疾病所用時間大幅縮減，檢測效率得到有效保障，為檢測山羊易患的人畜共患寄生蟲疾病提供技術支撐。

技術領域

本申請涉及人畜共患疫病技術領域，具體而言，涉及一種人畜共患寄生蟲多重PCR檢測方法。

背景技術

山羊等養殖動物易患多種人畜共患疫病，一方面對動物健康造成影響，使養殖經濟效益下滑，另一方面嚴重危害養殖從業人員、消費者和科技工作人員的身體健康。目前針對這些疫病的檢測技術大部分采用單一病原的ELISA或PCR檢測，效率較為低下，有待開發同時針對多個病原的高效檢測技術。

發明內容

本申請的主要目的在于提供一種人畜共患寄生蟲多重PCR檢測方法，以改善相關技術中,檢測效率低下的問題。

為了實現上述目的，本申請提供了一種人畜共患寄生蟲多重PCR檢測方法，具體包括以下步驟：

S1、獲取DNA，從動物血液中和糞便中分別獲取DNA；

S2、混合，將獲得的血液DNA和糞便DNA，分別制備成濃度為25ng/μL的DNA溶液，并將兩者的DNA溶液混合，混合后按照10倍倍比稀釋成若干個濃度梯度；

S3、多重PCR擴增，對獲得的若干濃度梯度的DNA溶液進行多重PCR擴增，多重PCR擴增的參數為：混合底物1μL，上下游引物各0.5μL，2×HiFi Amplification Mix 10μL，ddH₂O補足20μL，94℃預變性2min，98℃變性10s，60℃退火30s，68℃延伸15s，重復35個循環，即完成擴增過程；

S4、獲得結果，利用瓊脂糖凝膠電泳觀察，以不出現明顯條帶的前一個濃度為最低檢測濃度，并對最低檢測濃度及以上濃度的擴增溶液，進行DNA結構和功能的分析，進而判斷出寄生蟲的種類。

在本申請的一種實施例中，所述S1中，獲取DNA的具體方式為，先獲取血液樣本和糞便樣本，分別按照血液DNA提取試劑盒和糞便DNA提取試劑盒操作要求提取DNA，即可獲得血液DNA和糞便DNA。

在本申請的一種實施例中，所述S2中，濃度梯度設置有9個，且各濃度梯度分別為2.5×10¹ng/μL、2.5×10⁰ng/μL、2.5×10^-1ng/μL、2.5×10^-2ng/μL、2.5×10^-3ng/μL、2.5×10^-4ng/μL、2.5×10^-5ng/μL、2.5×10^-6ng/μL和2.5×10^-7ng/μL。

在本申請的一種實施例中，所述S3中，循環個數的確定方式為：分別設計循環數為20、25、30、35和40個循環，2.5×10^-5ng/μL DNA混合物1μL，上下游引物各0.5μL，2×HiFiAmplification Mix 10μL，ddH₂O加至20μL，94℃預變性2min，98℃變性10s，60℃退火30s，68℃延伸15s，瓊脂糖凝膠電泳觀察，以出現明顯條帶的那一個循環數為最佳的循環數，最佳的循環數為35。

在本申請的一種實施例中，所述瓊脂糖凝膠電泳觀察的具體方式為：用2％的瓊脂糖凝膠，120V電壓下電泳35min，EB溴乙錠染色紫外儀下觀察，且配膠體系如下：