[發(fā)明專利]一種人畜共患寄生蟲多重PCR檢測方法

在審

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• 申請日: 2021-08-06
• 公開（公告）號: CN113604581A
• 公開（公告）日: 2021-11-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 戴建軍;孫玲偉;張德福;陳旭;吳彩鳳;徐皆歡;張樹山
• 申請（專利權(quán)）人: 上海市農(nóng)業(yè)科學院
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 西安碩大知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 61283
• 代理人: 楊哲

1.一種人畜共患寄生蟲多重PCR檢測方法，其特征在于，具體包括以下步驟：

S1、獲取DNA，從動物血液中和糞便中分別獲取DNA；

S2、混合，將獲得的血液DNA和糞便DNA，分別制備成濃度為25ng/μL的DNA溶液，并將兩者的DNA溶液混合，混合后按照10倍倍比稀釋成若干個濃度梯度；

S3、多重PCR擴增，對獲得的若干濃度梯度的DNA溶液進行多重PCR擴增，多重PCR擴增的參數(shù)為：混合底物1μL，上下游引物各0.5μL，2×HiFiAmplification Mix 10μL，ddH₂O補足20μL，94℃預(yù)變性2min，98℃變性10s，60℃退火30s，68℃延伸15s，重復(fù)35個循環(huán)，即完成擴增過程；

S4、獲得結(jié)果，利用瓊脂糖凝膠電泳觀察，以不出現(xiàn)明顯條帶的前一個濃度為最低檢測濃度，并對最低檢測濃度及以上濃度的擴增溶液，進行DNA結(jié)構(gòu)和功能的分析，進而判斷出寄生蟲的種類。

2.如權(quán)利要求1所述的一種人畜共患寄生蟲多重PCR檢測方法，其特征在于，所述S1中，獲取DNA的具體方式為，先獲取血液樣本和糞便樣本，分別按照血液DNA提取試劑盒和糞便DNA提取試劑盒操作要求提取DNA，即可獲得血液DNA和糞便DNA。

3.如權(quán)利要求1所述的一種人畜共患寄生蟲多重PCR檢測方法，其特征在于，所述S2中，濃度梯度設(shè)置有9個，且各濃度梯度分別為2.5×10¹ng/μL、2.5×10⁰ng/μL、2.5×10^-1ng/μL、2.5×10^-2ng/μL、2.5×10^-3ng/μL、2.5×10^-4ng/μL、2.5×10^-5ng/μL、2.5×10^-6ng/μL和2.5×10^-7ng/μL。

4.如權(quán)利要求1所述的一種人畜共患寄生蟲多重PCR檢測方法，其特征在于，所述S3中，循環(huán)個數(shù)的確定方式為：分別設(shè)計循環(huán)數(shù)為20、25、30、35和40個循環(huán)，2.5×10^-5ng/μL DNA混合物1μL，上下游引物各0.5μL，2×HiFi Amplification Mix 10μL，ddH₂O加至20μL，94℃預(yù)變性2min，98℃變性10s，60℃退火30s，68℃延伸15s，瓊脂糖凝膠電泳觀察，以出現(xiàn)明顯條帶的那一個循環(huán)數(shù)為最佳的循環(huán)數(shù)，最佳的循環(huán)數(shù)為35。

5.如權(quán)利要求1或4所述的一種人畜共患寄生蟲多重PCR檢測方法，其特征在于，所述瓊脂糖凝膠電泳觀察的具體方式為：用2％的瓊脂糖凝膠，120V電壓下電泳35min，EB溴乙錠染色紫外儀下觀察，且配膠體系如下：

小膠：0.4g瓊脂粉、20ml TAE、2μL EB，微波爐加熱2～3min直至溶液透明清亮，倒入容器，插入梳子；

中膠：0.8g瓊脂粉、40ml TAE、4μL EB，微波爐加熱2～3min直至溶液透明清亮，倒入容器，插入梳子；

大膠：1.6g瓊脂粉、80ml TAE、8μL EB，微波爐加熱3～4min直至溶液透明清亮，倒入容器，插入梳子。

6.如權(quán)利要求1所述的一種人畜共患寄生蟲多重PCR檢測方法，其特征在于，所述S3中，退火溫度的確定方式為：設(shè)置50℃、52℃、54℃、56℃、58℃和60℃的退火溫度，觀察擴增條帶的明暗與清晰度來選擇最佳的退火溫度，最佳的退火溫度為60℃。