[發明專利]一種布魯氏菌L7/L12和GroES真核表達載體的構建方法及其應用

有效

• 申請號: 202110903398.X
• 申請日: 2021-08-06
• 公開（公告）號: CN113637703B
• 公開（公告）日: 2023-08-25
• 發明（設計）人: 吳同壘;肖麗榮;史秋梅;張志強;周詩淼;冀夢瑤
• 申請（專利權）人: 河北科技師范學院
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66;A61K39/10;A61K39/385;A61P31/04
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 崔自京

本發明公開了一種布魯氏菌L7/L12和GroES真核表達載體的構建方法及其應用，屬于生物技術領域。本發明公開的一種布魯氏菌L7/L12和GroES真核表達載體的構建方法，利用OverlapPCR方法連接基因L7/L12和GroES，利用pcDNA3.1構建真核表達載體pcDNA3.1?LG。真核表達載體pcDNA3.1?LG用于制備布魯氏菌疫苗。本發明通過構建L7/L12和GroES的融合表達真核載體，免疫小鼠后，機體產生了良好的體液和細胞免疫力，為布魯氏菌核酸疫苗的開發奠定了重要基礎。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，更具體的說是涉及一種布魯氏菌L7/L12和GroES真核表達載體的構建方法及其應用。

背景技術

布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的人獸共患傳染病，給牛羊養殖業造成了巨大經濟損失，同時嚴重威脅人類健康。疫苗免疫是預防布魯氏菌病較為有效的方法，商品化的布魯氏菌疫苗有A19、S2、Rev1、M5和RB51等，均為弱毒疫苗，但是存在安全性不足的缺點，例如A19可導致懷孕動物流產，并存在排毒風險，且大都能夠感染人并引起一過性疾病。DNA疫苗安全性高，且現有研究顯示某些基因能夠刺激機體產生較強的保護力，逐漸得到人們的重視。

基于布魯氏菌L7/L12基因的DNA疫苗在能夠產生良好的保護作用。GroES是熱休克蛋白hsp60家族的輔助蛋白，可以激活宿主免疫反應，同時參與抗原呈遞，增強宿主免疫應答水平。

因此，提供一種布魯氏菌L7/L12和GroES真核表達載體的構建方法及其應用是本領域技術人員亟需解決的問題。

發明內容

有鑒于此，本發明提供了一種布魯氏菌L7/L12和GroES真核表達載體的構建方法及其應用。

為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種布魯氏菌L7/L12和GroES真核表達載體的構建方法，具體步驟如下：

(1)提取B.abortus?2308基因組DNA；

(2)利用引物LG-1和LG-2?PCR擴增L7/L12基因，LG-3和LG-4?PCR擴增GroES基因；擴增產物純化后1：1混勻作為重疊PCR的模板，以引物LG1和LG4進行擴增，將L7/L12和GroES兩個基因連接，獲得L7/L12-GroES；

其中，LG-1和LG-2以及LG-3和LG-4的引物序列如下：

LG-1：5’-GCGGATCCACCATGGTGGCTGATCTCGCAAAGATCGTT-3’；SEQ?ID?NO.1；

LG-2：5’-GCGCTCGGGCAGTATCATCATTCCTCCCTTGAGTTCAACCTTGGCGCCAGCA-3’；SEQID?NO.2；

LG-3：5’-GGCGCCAAGGTTGAACTCAAGGGAGGAATGATGATACTGCCCGAGCGCCT-3’；SEQ?IDNO.3；

LG-4：5’-GCCTCGAGTCAGACAAGCGCATGTAGAGAAGCA-3’；SEQ?ID?NO.4；

(3)將純化后的L7/L12-GroES與質粒pcDNA3.1進行雙酶切、連接和轉化，涂布Amp平板培養過夜；挑取單菌落進行PCR鑒定，獲得陽性克隆，提取質粒，經測序驗證正確，獲得真核表達載體pcDNA3.1-LG。

進一步，步驟(2)所述PCR和重疊PCR的反應體系為：上下游引物各1μL，DNA模板1μL，PCR?Mixture?25μL，蒸餾水補齊50μL；反應條件為：94℃預變性5min；94℃?60s，50℃30s，72℃延伸60s，32個循環；72℃終末延伸8min。