[發明專利]一種布魯氏菌L7/L12和GroES真核表達載體的構建方法及其應用

有效

• 申請號: 202110903398.X
• 申請日: 2021-08-06
• 公開（公告）號: CN113637703B
• 公開（公告）日: 2023-08-25
• 發明（設計）人: 吳同壘;肖麗榮;史秋梅;張志強;周詩淼;冀夢瑤
• 申請（專利權）人: 河北科技師范學院
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66;A61K39/10;A61K39/385;A61P31/04
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 崔自京

1.一種布魯氏菌L7/L12和GroES真核表達載體的構建方法，其特征在于，具體步驟如下：

（1）提取B.abortus?2308基因組DNA；

（2）利用引物LG-1和LG-2PCR擴增L7/L12基因，LG-3和LG-4PCR擴增GroES基因；擴增產物純化后1：1混勻作為重疊PCR的模板，以引物LG1和LG4進行擴增，將L7/L12和GroES兩個基因連接，獲得L7/L12-GroES；

其中，LG-1和LG-2以及LG-3和LG-4的引物序列如下：

LG-1：5′-GCGGATCCACCATGGTGGCTGATCTCGCAAAGATCGTT-3′，SEQ?ID?NO.1；

LG-2：5′-GCGCTCGGGCAGTATCATCATTCCTCCCTTGAGTTCAACCT

TGGCGCCAGCA-3′，SEQ?ID?NO.2；

LG-3：5′-GGCGCCAAGGTTGAACTCAAGGGAGGAATGATGATACTG

CCCGAGCGCCT-3′，SEQ?ID?NO.3；

LG-4：5′-GCCTCGAGTCAGACAAGCGCATGTAGAGAAGCA-3′，SEQ?ID?NO.4；

（3）將純化后的L7/L12-GroES與質粒pcDNA3.1進行雙酶切、連接和轉化，涂布Amp平板培養過夜；挑取單菌落進行PCR鑒定，獲得陽性克隆，提取質粒，經測序驗證正確，獲得真核表達載體pcDNA3.1-LG。

2.根據權利要求1所述的一種布魯氏菌L7/L12和GroES真核表達載體的構建方法，其特征在于，步驟(2)所述PCR和重疊PCR的反應體系為：上下游引物各1μL，DNA模板1μL，PCRMixture?25μL，蒸餾水補齊50μL；反應條件為：94℃預變性5min；94℃?60s，50℃?30s，72℃延伸60s，32個循環；72℃終末延伸8min。

3.根據權利要求1所述的一種布魯氏菌L7/L12和GroES真核表達載體的構建方法構建的布魯氏菌L7/L12和GroES真核表達載體在制備布魯氏菌疫苗中的應用。