[發明專利]一種制備用于棉花胚珠空間轉錄組分析的切片的方法

有效

• 申請號: 202110900264.2
• 申請日: 2021-08-06
• 公開（公告）號: CN113640080B
• 公開（公告）日: 2023-05-23
• 發明（設計）人: 馬雄風;孫旭武;劉祉辛;張先亮;代帥;梅崢;任翔;藏新山;劉浩
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院棉花研究所;河南大學
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28;G01N1/36;G01N1/34;G01N1/42;G01N1/30
• 代理公司: 北京象合知識產權代理事務所(普通合伙) 11893
• 代理人: 封明艷

本發明涉及植物空間轉錄組學領域，主要涉及到一種制備用于棉花胚珠空間轉錄組分析的切片的方法。所述方法包括步驟：將在冰上預冷后的OCT注入包埋盒，將新鮮棉花胚組織放入裝有OCT的包埋盒中，再用OCT覆蓋暴露的組織表面；OCT完全凍結后進行切片和制片。本發明方法利用新鮮組織快速低溫包埋后切片，獲得了結構清晰、完整的冰凍切片，并可用于空間轉錄組學，得到一個完整的組織樣本中產生的全部轉錄組數據，能夠定位和區分功能基因在特定的組織區域內表達情況。根據差異基因的表達情況分析調控細胞群命運、空間組織、集體生長的關鍵因子，空間基因表達模式的詳細分析對于闡述植物發育過程中復雜的調控網絡至關重要。

技術領域

本發明涉及植物空間轉錄組學領域，主要涉及到一種制備用于棉花胚珠空間轉錄組分析的切片的方法。

背景技術

組織系統由不同的細胞亞群組成，它們在特定組織中的空間位置與它們的功能緊密交織在一起。了解組織系統需要了解它們的組成部分。盡管單細胞RNA測序(scRNA-seq)是解決轉錄異質性的有力工具，這種單細胞分析的應用極大地促進了發育過程的實驗研究。然而，在scRNA-seq必要的組織解離步驟中分離單個細胞會破壞有關它們在天然組織中的空間定位以及它們彼此接近的信息，這種空間信息對于理解正常和脅迫組織下的細胞間通訊是至關重要的。為了克服這些不足，空間轉錄組學(ST)允許將RNA-Seq轉錄本數據空間映射到高分辨率組織圖像上，空間信息通過使用由1000個點(100-μm圓形區域)和條形碼捕獲探針組成的獨特微陣列來保持。空間轉錄組學(ST)可以揭示出豐富的不同基因組的生態位。這將細胞亞群定位到它們所在的組織“鄰里”，并指定它們表達的配體和受體，以影響局部細胞間的通訊。當空間轉錄組學和單細胞RNA測序(scRNA-seq)聯合使用時，可以在其天然組織環境中定位轉錄特征的單個細胞。ST已經被用于研究小鼠嗅球，乳腺癌，黑色素瘤，前列腺癌，牙齦組織，成人心臟組織，小鼠以及模式植物。

與哺乳動物系統相比，植物組織和細胞面臨著許多特殊的挑戰，包括植物細胞壁、液泡、葉綠體和次生代謝物。這些特性需要與哺乳動物組織相比有很大不同的操作程序，并且通常需要針對物種或組織進行特定的優化。在進行空間轉錄組學分析時，冷凍切片的制作至關重要。組織切片的質量和完整性直接決定了空間轉錄組數據的準確性。

按照現有文獻報道的關于植物組織冰凍切片方法進行了棉花胚珠的切片，發現經過液氮速凍后的棉花組織十分脆弱，經包埋固定后切片效果不理想，大部分冰凍切片中棉花胚珠破碎，失去完整性。分析其原因，與現有報道的關于植物冰凍切片方法相比，可能是因為棉花胚珠組織中子房壁、胎座等結構相關，這些結構在不同厚度切片下，形態存在差異。另外，棉花胚珠含有木質素，在冰凍狀態下也可能導致組織脆弱。目前關于用于空間轉錄組學分析的植物組織冰凍切片的方法還不完善，沒有成熟的技術體系用于制備空間轉錄組學分析所需的植物組織冰凍切片。

發明內容

基于上述問題，本發明的目的在于克服上述現有技術的不足，提供一種制備用于棉花胚珠空間轉錄組分析的切片的方法。

根據本發明的制備用于棉花胚珠空間轉錄組分析的切片的方法包括以下步驟：

5)取新鮮取棉花胚組織，修剪成合適大小的組織塊，清洗干凈并吸干水分，置于培養皿中；

6)將在冰上預冷后的OCT注入包埋盒，將新鮮棉花胚組織放入裝有OCT的包埋盒中，再用OCT覆蓋暴露的組織表面，確認在組織附近沒有氣泡，將含有棉花胚組織和OCT的包埋盒進行冷凍凝固；

7)切片：OCT完全凍結后進行切片，將樣品托固定到冰凍切片機的預冷樣品托持承器上，進行切片，切片厚度為8-10μm；

8)制片：將切片平展于速凍臺上，調整切片的角度，將切片貼在空間轉錄組專用的玻片上，得到用于棉花胚珠空間轉錄組分析的切片。

根據本發明的制備用于棉花胚珠空間轉錄組分析的切片的方法，其中，在步驟1)中，修剪棉花胚組織的大小為6.5mm×6.5mm。