[發明專利]一種基于網狀雜交鏈式反應的基因鏈檢測方法

在審

• 申請號: 202110897288.7
• 申請日: 2021-08-05
• 公開（公告）號: CN113604541A
• 公開（公告）日: 2021-11-05
• 發明（設計）人: 朱曲波;陳傳品;董佳妮
• 申請（專利權）人: 中南大學
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/682
• 代理公司: 長沙市融智專利事務所(普通合伙) 43114
• 代理人: 袁靖

本發明公開了一種基于網狀雜交鏈式反應基因鏈檢測方法。包括：(1)提取總RNA：從待檢測的樣本中提取總RNA；(2)逆轉錄滾環擴增；(3)網狀雜交鏈式反應探針設計；(4)網狀雜交鏈式反應；(5)熒光信號測定。該方法不僅可以靈敏且特異的檢測生物樣本中的環狀RNA，對于了解環狀RNA的生物學功能和追蹤疾病進程有重要意義，而且還適用于一些含有多段重復序列的基因檢測，如對端粒DNA也有應用潛力。

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，具體涉及一種基于網狀雜交鏈式反應的基因鏈特異性檢測方法。

背景技術

環狀RNA(circRNA)作為一類新出現的生物標志物，它在多種疾病的發生發展中扮演著非常重要的角色，特別是在癌癥中。一些特定的環狀RNA在腫瘤與正常組織中的表達量有著顯著的差異。多項研究表明環狀RNA可以通過多種機制參與腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移。然而，近年來檢測方法的局限性卻嚴重限制了circRNA的相關研究。

到目前為止，大多數對環狀RNA的研究都是基于測序方法，雖然可以獲得轉錄組的信息，但是依舊迫切需要定量臨床樣品中特定環狀RNA的策略。幾種傳統的分子生物學方法也已經用于環狀RNA的檢測，包括凝膠電泳，逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)，熒光原位雜交(FISH)等。近年來一些新興的環狀RNA檢測技術進入人們視野。環介導的等溫擴增(LAMP)技術、雙鏈特異性核酸酶(DSN)、滾環擴增(RCA)都被用于circRNA的檢測。

傳統的凝膠電泳只能以極低的靈敏度區分環狀RNA和線性RNA。RT-qPCR雖然能夠實現對環狀RNA的靈敏檢測，但是逆轉錄過程中的滾環擴增會導致豐度的偽增加。FISH技術可用于直接的環狀RNA原位檢測，但它產生的檢測信號低，需要先進的顯微鏡來獲取。而新興的環狀RNA檢測技術則普遍存在著假陽性問題，以及引物設計的困難。而且，大多數都依賴于RNase R的富集處理。考慮到circRNA的獨特結構和極低的表達水平，對circRNA檢測方法的不斷改進是必要的。

發明內容

本發明的目的是提供一種基于網狀雜交鏈式反應基因鏈檢測方法，該方法不僅可以靈敏且特異的檢測生物樣本中的環狀RNA，對于了解環狀RNA的生物學功能和追蹤疾病進程有重要意義，而且還適用于一些含有多段重復序列的基因檢測，如對端粒DNA也有應用潛力。

一種基于網狀雜交鏈式反應的基因鏈檢測方法，針對circRNA的檢測步驟如下：

(1)提取總RNA：從待檢測樣本中提取總RNA；

(2)逆轉錄滾環擴增：針對要檢測的目標circRNA，在非反向剪切位點的靶序列處選取堿基設計特異性逆轉錄引物；優選18-25個堿基設計，進一步優選20個堿基設計特異性逆轉錄引物；該引物特異性識別目標circRNA，用不含RNase H的高效逆轉錄酶進行滾環逆轉錄，逆轉錄得到一條長的具有多組重復序列的cDNA單鏈(圖1a)(至少2個重復序列，優選3-10個重復序列)，該cDNA鏈上含有多個逆轉錄后的反向剪切位點序列；而相應的線性RNA則無法進行持續的逆轉錄(圖1b)；此外，首尾相連的線性RNA僅可以逆轉錄得到帶有一組反向剪切位點的cDNA。通過circRNA的RT-RCA過程對目標circRNA進行第一次的篩選與擴增，實現第一次的信號放大。

(3)網狀雜交鏈式反應探針設計：CircRNA與其線狀異構體具有相同的主體序列，二者區別在于反向剪切位點(Backsplice junction)處的序列不同。針對cDNA鏈上存在的多個逆轉錄后的反向剪切位點序列，設計三個HCR探針：Trigger、H1、H2；Trigger用來識別逆轉錄后的反向剪切位點序列并啟動網狀雜交鏈式反應，探針H1、H2進行DNA網狀納米結構的搭建；(圖1c)

(4)網狀雜交鏈式反應：將探針Trigger、H1與H2同逆轉錄滾環擴增得到的cDNA鏈在一定溫度下共孵育；

(5)熒光信號測定：通過對熒光信號的檢測，實現對circRNA的檢測；