[發明專利]一種基于網狀雜交鏈式反應的基因鏈檢測方法

在審

• 申請號: 202110897288.7
• 申請日: 2021-08-05
• 公開（公告）號: CN113604541A
• 公開（公告）日: 2021-11-05
• 發明（設計）人: 朱曲波;陳傳品;董佳妮
• 申請（專利權）人: 中南大學
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/682
• 代理公司: 長沙市融智專利事務所(普通合伙) 43114
• 代理人: 袁靖

1.一種基于網狀雜交鏈式反應的基因鏈檢測方法，其特征在于，針對circRNA的檢測步驟如下：

(1)提取總RNA：從待檢測樣本中提取總RNA；

(2)逆轉錄滾環擴增：針對要檢測的目標circRNA，在非反向剪切位點的靶序列處選取堿基設計特異性逆轉錄引物；該引物特異性識別目標circRNA，用不含RNase H的高效逆轉錄酶進行滾環逆轉錄，逆轉錄得到一條長的具有多組重復序列的cDNA單鏈，該cDNA鏈上含有多個逆轉錄后的反向剪切位點序列；

(3)網狀雜交鏈式反應探針設計：針對cDNA鏈上存在的多個逆轉錄后的反向剪切位點序列，設計三個HCR探針：Trigger、H1、H2；Trigger用來識別逆轉錄后的反向剪切位點序列并啟動網狀雜交鏈式反應，探針H1、H2進行DNA網狀納米結構的搭建；

(4)網狀雜交鏈式反應：將探針Trigger、H1與H2同逆轉錄滾環擴增得到的cDNA鏈在一定溫度下共孵育；

(5)熒光信號測定：通過對熒光信號的檢測，實現對circRNA的檢測；

針對含有多段重復序列的基因檢測時，除了網狀雜交鏈式反應探針是針對DNA鏈上存在的多個重復序列設計的三個HCR探針，并省略掉上述步驟(1)的提取總RNA和步驟(2)的逆轉錄滾環擴增過程外，其余步驟均同于上述針對circRNA的檢測步驟。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中在沒有目標反向剪切位點存在的情況下，三個探針保持穩定的發夾結構，不會自發發生自組裝；在逆轉錄后的反向剪切位點存在的情況下，發夾探針Trigger與之部分結合發生構象改變，發夾打開，暴露啟動子鏈；啟動子鏈與H1的發夾結構發生鏈置換，暴露出兩段具有特殊作用的序列；其中一段序列與發夾探針H2發生鏈置換，使H2也釋放出與Trigger相同的啟動子鏈；該啟動子鏈繼續與H1、H2進行循環往復的后續組裝；而另一段序列是位于H1探針5’端的尾巴，與相鄰的H1結合，拉近兩個HCR體系之間的距離；由于多組重復序列的存在，它們被H1串聯在一起，搭建起穩定的網狀結構。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，信號的輸出依賴于H1探針上標記的熒光基團與淬滅基團；發夾結構時熒光基團與淬滅基團在空間上緊鄰，由于熒光共振能量轉移原理熒光淬滅；而在發夾結構打開時熒光基團與淬滅基團在空間上距離拉開，熒光恢復。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中：Trigger探針包括a'、b'、c、b四部分，其中a'、b'段與逆轉錄后的反向剪切位點處序列互補配對，且分別包含6-10個、10-14個堿基，c為6-12個隨機堿基序列，b為b'的互補配對序列；H1包括d'、e、b、d、b'、c'，d'為4-8個隨機堿基序列，e為5-7個隨機堿基序列，d、c'分別為d'、c的互補配對序列；H2包括b'、e'、c、b四部分，其中e'為e的互補配對序列；在沒有目標反向剪切位點存在的情況下，三個探針保持穩定的發夾結構，不會自發發生自組裝；在逆轉錄后的反向剪切位點存在的情況下，發夾探針Trigger與之部分結合發生構象改變，發夾打開，暴露啟動子鏈；啟動子鏈與H1的發夾結構發生鏈置換，暴露出兩段具有特殊作用的序列；其中一段序列與發夾探針H2發生鏈置換，使H2也釋放出與Trigger相同的啟動子鏈；該啟動子鏈繼續與H1、H2進行循環往復的后續組裝；而另一段序列是位于H1探針5’端的尾巴，與相鄰的H1結合，拉近兩個HCR體系之間的距離；由于多組重復序列的存在，它們被H1串聯在一起，搭建起穩定的網狀結構。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)中網狀雜交鏈式反應的孵育溫度為27℃-33℃，孵育時間為3h-4h。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)中探針Trigger、H1與H2的終濃度分別為0.03-0.07μM、0.08-0.15μM與0.08-0.15μM。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，H1探針上標記的熒光基團為FAM，淬滅基團為BHQ-1。