[發(fā)明專利]快速高效的臨床級色素上皮細胞誘導(dǎo)方法、試劑盒及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110894939.7
• 申請日: 2021-08-05
• 公開（公告）號: CN113528441B
• 公開（公告）日: 2022-09-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 吳理達;顧雨春
• 申請（專利權(quán)）人: 呈諾再生醫(yī)學(xué)科技（珠海橫琴新區(qū)）有限公司
• 主分類號: C12N5/079
• 分類號: C12N5/079;C12N5/074;A61K35/30;A61P27/02
• 代理公司: 北京預(yù)立生科知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11736
• 代理人: 李紅偉;孟祥斌

1.一種RDM1培養(yǎng)基，所述RDM1培養(yǎng)基由50 ng/mL的noggin、1μM的XAV-939、5μM的LY2109761、10uM的Thiazovivin和基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成；

所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基是由DMEM/F12，KSR，Monothioglycerol Solution，ChemicallyDefined Lipid Concentrate，谷氨酰胺組成。

2.如權(quán)利要求1所述的RDM1培養(yǎng)基，其特征在于，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基由88% DMEM/F12，10%KSR，5mM Monothioglycerol Solution，1% Chemically Defined Lipid Concentrate，1%L-谷氨酰胺組成。

3.如權(quán)利要求1所述的RDM1培養(yǎng)基，其特征在于，所述KSR替代為其他血清類似物替代，所述其他血清類似物包括FBS、馬血清、HAS、BSA；所述谷氨酰胺替代為GlutaMAX?Supplement或L-谷氨酰胺。

4.一種誘導(dǎo)iPSC分化為高表達PAX6的細胞的方法，所述方法包括使用權(quán)利要求1-3任一項所述的RDM1培養(yǎng)基培養(yǎng)iPSC細胞6天。

5.權(quán)利要求1-3任一項所述的RDM1培養(yǎng)基在誘導(dǎo)iPSC分化為高表達PAX6的細胞中的應(yīng)用。

6.一種培養(yǎng)基的組合物，所述組合物中包括權(quán)利要求1-3任一項所述的RDM1培養(yǎng)基和以下至少一種培養(yǎng)基：RDM2培養(yǎng)基、RDM3培養(yǎng)基、RDM4培養(yǎng)基、RMM培養(yǎng)基、REM培養(yǎng)基；

所述RDM2培養(yǎng)基由10μM的6-bromoindirubin-3′-oxime、2μM的SU5402、10μM的Thiazovivin和基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成；所述RDM3培養(yǎng)基由10μM的6-bromoindirubin-3′-oxime、2μM的SU5402、10μM的Thiazovivin、10mM的Vitamin B3和基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成；

所述RDM4培養(yǎng)基由89% DMEM/F12，10% KSR，1% N2培養(yǎng)基，1% L-谷氨酰胺以及10mMVitamin B3組成；

所述RMM培養(yǎng)基由97% DMEM/F12，2% B27培養(yǎng)基，1% L-谷氨酰胺組成；

所述REM培養(yǎng)基由79% DMEM/F12，20% KSR，1% L-谷氨酰胺，50μM β巰基乙醇組成；

所述RDM2培養(yǎng)基、RDM3培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基由DMEM/F12，KSR， MonothioglycerolSolution， Chemically Defined Lipid Concentrate，L-谷氨酰胺組成。

7.如權(quán)利要求6所述的培養(yǎng)基的組合物，其特征在于，所述RDM2培養(yǎng)基、RDM3培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基由88% DMEM/F12，10% KSR，5mM Monothioglycerol Solution，1% ChemicallyDefined Lipid Concentrate，1% L-谷氨酰胺組成。

8.一種誘導(dǎo)視網(wǎng)膜色素上皮細胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

1）使用權(quán)利要求1-3任一項所述的RDM1培養(yǎng)基和權(quán)利要求6所述組合物中的RDM2培養(yǎng)基誘導(dǎo)iPSC細胞分化為RPE祖細胞的步驟；

2）使用權(quán)利要求6所述組合物中的RDM3培養(yǎng)基和權(quán)利要求6所述組合物中的RDM4培養(yǎng)基誘導(dǎo)色素上皮前體細胞的步驟；

3）使用權(quán)利要求6所述組合物中的RMM培養(yǎng)基誘導(dǎo)色素上皮細胞成熟的步驟；

4）使用權(quán)利要求6所述組合物中的REM培養(yǎng)基進行色素上皮細胞傳代培養(yǎng)的步驟；

使用所述RDM1培養(yǎng)基的時間為第1-6天，使用所述RDM2培養(yǎng)基的時間為第7-12天，使用所述RDM3培養(yǎng)基的時間為第13-17天，使用所述RDM4培養(yǎng)基的時間為第18-24天，使用所述RMM培養(yǎng)基的時間為第25-36天，使用所述REM培養(yǎng)基的時間為第37天之后。

9.權(quán)利要求6所述的組合物在誘導(dǎo)視網(wǎng)膜色素上皮細胞中的應(yīng)用。