[發明專利]快速高效的臨床級色素上皮細胞誘導方法、試劑盒及應用

有效

• 申請號: 202110894939.7
• 申請日: 2021-08-05
• 公開（公告）號: CN113528441B
• 公開（公告）日: 2022-09-13
• 發明（設計）人: 吳理達;顧雨春
• 申請（專利權）人: 呈諾再生醫學科技（珠海橫琴新區）有限公司
• 主分類號: C12N5/079
• 分類號: C12N5/079;C12N5/074;A61K35/30;A61P27/02
• 代理公司: 北京預立生科知識產權代理有限公司 11736
• 代理人: 李紅偉;孟祥斌

本發明涉及生物技術領域，具體涉及快速高效的臨床級色素上皮細胞誘導方法、試劑盒及應用。本發明提供了一種快速高效誘導視網膜色素上皮細胞的方法，通過3個階段，定向誘導iPSC，極大的縮短了RPE產生時間；具體地，所述方法包括使用含有小分子化合物的培養基進行細胞培養，所述小分子化合物包括BMP信號通路抑制劑，Wnt通路抑制劑，TGF?βI型受體ALK5、ALK4和ALK7的抑制劑，ROCK通路抑制劑，WNT信號通路激活劑，VEGFR激酶抑制劑，GSK信號通路抑制劑，VEGFR激酶抑制劑，維生素及其類似物。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及快速高效的臨床級色素上皮細胞誘導方法、試劑盒及應用。

背景技術

眼是人類的重要器官，而視網膜退行性疾病可致盲，給患者帶來極大的痛苦。視網膜退行性疾病主要包括視網膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)、黃斑變性以及遺傳性視網膜退行等，這些疾病存在著不同的癥狀以及相關致病基因或易感基因。盡管這些疾病的病因和病理進程各不相同，但都存在視網膜細胞數量的進行性減少，主要包括視網膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelium，RPE)和光感受器細胞的不可逆損失，并最終導致視覺功能喪失。RP為遺傳性疾病，目前已發現200多個與RP相關的基因突變位點。黃斑變性是由基因改變和環境因素共同引起，根據患病年齡分為少年黃斑變性和年齡相關性黃斑變性(age related-macular degeneration，AMD)。臨床上RP和AMD較為普遍，其中RP的發病率高達1/3000；而AMD在大于60歲的人群中的發病率超過1/10。目前，臨床上用來治療視網膜退行性疾病的藥物和方法非常有限，多數為抗炎治療及神經細胞營養保護性視網膜退行性疾病藥物用以延緩病程，或者抑制血管生長類藥物以治療濕性AMD等。

但是藥物治療無法恢復已經受損的視神經細胞和功能RPE細胞，而利用細胞移植手段則可以有針對性地將有特定功能的細胞移植并整合到視網膜中以恢復其受損功能，應用前景更為廣泛。目前，細胞移植是治療退行性眼病的重要方法之一。針對視網膜退行性疾病的細胞替代療法形式的再生醫學具有廣闊的前景，因為無論潛在的遺傳原因或后天原因，均可使用相同的治療劑。現代干細胞技術已經產生了臨床級別的細胞療法，目前正在研究人類胚胎干細胞(hESCs)和誘導性多能干細胞(iPSCs)治療視網膜變性。目前的分化方法存在的主要不足在于誘導分化耗時長(90-140天)，以及移植后RPE(視網膜色素上皮細胞)的功能性差和存活率低。

發明內容

本發明提供了一種快速高效誘導視網膜色素上皮細胞的方法，通過外胚層分化、色素上皮前體細胞分化、視網膜色素上皮細胞成熟這3個階段，定向誘導iPSC，極大的縮短了RPE產生時間；每個階段針對特定的信號通路，促進iPSC分化。

本發明所提供的方法能夠縮短誘導分化時間，并且能得到功能和活力均比較穩定的RPE細胞，最終可以用于移植治療。同時，本發明提供了誘導視網膜色素上皮細胞的培養基、培養基組合、試劑盒及其應用。

第一方面，本發明提供了一種快速高效誘導視網膜色素上皮細胞的方法，所述方法包括誘導外胚層分化的步驟和誘導色素上皮前體細胞分化的步驟。

優選地，所述方法還包括誘導視網膜色素上皮細胞成熟的步驟。

優選地，所述方法還包括視網膜色素上皮細胞傳代的步驟。

本發明中“色素上皮細胞”“視網膜色素上皮細胞”“RPE”均表示相同含義，可以互換使用。

在一種實施方式中，所述誘導外胚層分化的步驟包括使用RDM1培養基和/或RDM2培養基培養干細胞。

優選地，所述干細胞包括全能干細胞、多能干細胞、單能干細胞。

優選地，所述干細胞是iPSC細胞(誘導性多能干細胞)。