[發明專利]一種自剪切蛋白標簽、改造方法及其應用

有效

• 申請號: 202110893289.4
• 申請日: 2021-08-04
• 公開（公告）號: CN113480613B
• 公開（公告）日: 2022-04-15
• 發明（設計）人: 夏海鋒;羅久沛;周挺峻
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C07K14/00
• 分類號: C07K14/00;C12N15/70;C12N15/62;C07K19/00;C07K1/22
• 代理公司: 南京禹為知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 32272
• 代理人: 王曉東

本發明提供一種自剪切蛋白標簽的改造方法和產品及其應用，其中，親和配體的構建是在對Cfa DnaE?C，即I_C的結構進行改造的基礎上進行的；在I_C的第12號位到第18號位之間的合適位置添加適量的甘氨酸，降低I_C蛋白的結構穩定性，用于優化洗脫條件，提升洗脫效果。本發明改變了I_C蛋白并沒有對內含肽的識別連接產生明顯的影響，在斷裂反應過程中可以看出斷裂率沒有明顯下降。此外，本發明的改造并沒有對親和介質的載量產生明顯的影響，在靜態吸附實驗過程中可以看出載量出現少量下降。本發明構建的親和純化介質具有較好的純化效果和較高的重復利用率。

技術領域

本發明屬于蛋白純化領域，涉及一種自剪切蛋白標簽的改造方法和產品及其應用。

背景技術

近年來隨著生物技術的不斷發展，純化技術越來越受到人們重視。親和層析技術是對重組蛋白分離純化的有效手段之一，具有易操作、純化效率高等特點，但是親和層析技術通常需要在目的蛋白中引入特殊的親和標簽。工業上常用的去標簽手段有內切酶法、化學法等，但處理手段往往耗時耗力且十分昂貴。

內含肽(Intein)是一段插入前體蛋白質中的基因序列，在加工翻譯的過程中能夠進行自我剪接，將自身從宿主蛋白中切除，并以肽鍵的形式連接兩側的蛋白質多肽鏈形成成熟蛋白，這個過程被稱為蛋白質剪接，其中位于N端和C端的蛋白多肽鏈被稱為N端和C端外顯肽(Extein)。內含肽具有自發的剪接作用，因此在蛋白質工程領域應用廣泛。雖然到目前為止發現的大多數內含肽都是連續的，但也存在少量的自然分裂的內含肽。分裂的內含肽域被單獨轉錄翻譯成兩個獨立的多肽，能自發地組裝重新構成一個功能性的內含肽，融合連接N端和C端外顯蛋白序列的過程被稱為反式剪接(PTS)。

斷裂內含肽作為一種特殊的內含肽提供了新的研究思路。當內含肽蛋白元件CfaDnaE-N，即I_N，和Cfa DnaE-C，即I_C兩者以單獨的片段表達時是不活躍的，在表達的過程中沒有斷裂現象，或斷裂現象被抑制，但在純化方案完成后可以被迅速激活。依據這些原理，建立了分裂的內含肽介導的無標記蛋白(Tagless Protein,SIRP)超快速純化系統。該系統直接利用內含肽的自我斷裂機制，創建了無標簽的蛋白純化手段。在該系統中，斷裂內含肽的N端在大腸桿菌中表達，并以共價鍵的方式固定在樹脂上，而較小的C端內含肽融合到目標蛋白的N端，然后標記的目標在適當的表達系統中表達，而不用擔心內含肽的提前斷裂。在純化過程中，在生產具有斷裂能力的內含肽復合物的同時，內含肽蛋白片段之間的有效識別。一旦該復合物在通過層析柱進行純化，經過pH調節誘導內含肽斷裂。這項技術的關鍵是在目標蛋白的N端添加一個短的、自我分裂的標簽，通過與所提供的樹脂的高特異性親和力來捕獲。一旦目標蛋白被捕獲和純化，一個小的pH值變化觸發標簽的自我斷裂，從而從捕獲樹脂中釋放無標簽的目標蛋白。

基于內含肽構建的親和層析介質純化過程中可以通過自我剪切作用去除標簽，有效的避免了標簽對蛋白的影響，簡化了蛋白純化的操作，但在其應用過程中也存在一些不足。

在使用過程中發現，弱堿性的洗脫條件下，I_C-GFP復合物上柱后無法完全洗脫；較強堿性的洗脫條件下，部分I_N蛋白會發生變性，這兩種情況都會導致二次使用的載量下降，影響介質的重復使用。

發明內容

本部分的目的在于概述本發明的實施例的一些方面以及簡要介紹一些較佳實施例。在本部分以及本申請的說明書摘要和發明名稱中可能會做些簡化或省略以避免使本部分、說明書摘要和發明名稱的目的模糊，而這種簡化或省略不能用于限制本發明的范圍。

鑒于上述和/或現有技術中存在的問題，提出了本發明。