[發明專利]一種自剪切蛋白標簽、改造方法及其應用

有效

• 申請號: 202110893289.4
• 申請日: 2021-08-04
• 公開（公告）號: CN113480613B
• 公開（公告）日: 2022-04-15
• 發明（設計）人: 夏海鋒;羅久沛;周挺峻
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C07K14/00
• 分類號: C07K14/00;C12N15/70;C12N15/62;C07K19/00;C07K1/22
• 代理公司: 南京禹為知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 32272
• 代理人: 王曉東

1.一種自剪切蛋白標簽，其特征在于：所述自剪切蛋白標簽，以SEQ ID No.1所示的CfaDnaE-C，即I_C氨基酸序列為出發序列，將第12到第13號位之間插入3～12個甘氨酸，即I_C^*，通過構建重組菌、表達純化，即得所述自剪切蛋白標簽。

2.如權利要求1所述的自剪切蛋白標簽，其特征在于：所述自剪切蛋白標簽，以SEQ IDNo.1所示氨基酸序列為出發序列，在第12和第13號位之間添加3、6或12個甘氨酸，通過構建重組菌、表達純化，即得所述自剪切蛋白標簽。

3.如權利要求1～2中任一所述的自剪切蛋白標簽的改造方法，其特征在于：包括，

設計引物：根據GeneBank提供的基因序列，利用分子生物學軟件Primer Premier 5基于重疊PCR設計I_C^*基因序列的引物；

重組菌的構建，以重組菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a-I_C為模板，利用引物進行改造：獲得改造后的蛋白I_C^*的基因序列，最后轉化感受態E.coli BL21(DE3)，得到改造后的重組I_C^*表達菌株E.coli BL21(DE3)/pET-28a-I_C^*；

改造后重組蛋白I_C^*的表達純化：對重組菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-I_C^*進行誘導表達，獲得改造后的重組蛋白I_C^*，即Cfa DnaE I_C^*；

所述重組菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-I_C，其中，菌株E.coli BL21(DE3)/pET-28a-I_C中的I_C序列為人工合成，末端添加氨基酸CFN，后連接到pET28a上，酶切位點為NdeI和HindIII。

4.如權利要求3所述的自剪切蛋白標簽的改造方法，其特征在于：所述設計引物，其中，所述引物序列包括：

A_F:AAGCCTGGGTACCCAAAACGTTGGAGGAGGATACGGCATTGGC；

A_R:GCCAATGCCGTATCCTCCTCCAACGTTTTGGGTACCCAGGCTT；

B_F:GGAGGAGGAGGAGGAGGATACGGCATTGGCGTCG；

B_R:TCCTCCTCCTCCTCCTCCAACGTTTTGGGTACCC；

C_F:GGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGATACGG；

C_R:TCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCAACGT；

其中，引物A_F，A_R可構建菌株pET28a-I_C^*12-3G-13，即在I_C第12位與13位間插入3個甘氨酸；

引物B_F，B_R可構建菌株pET28a-I_C^*12-6G-13，即在I_C第12位與13位間插入6個甘氨酸；

引物C_F，C_R可構建菌株pET28a-I_C^*12-12G-13，即在I_C第12位與13位間插入12個甘氨酸。

5.如權利要求3所述的自剪切蛋白標簽的改造方法，其特征在于：所述PCR反應條件包括：預變性94℃反應5min；變性94℃反應30s，退火溫度65℃反應30s，延伸溫度72℃延伸5min 30s，進行30個循環；最后72℃保持10min。