[發(fā)明專利]微滴數(shù)字PCR檢測前列腺癌組織中CTHRC1基因含量的方法

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• 申請日: 2021-08-04
• 公開（公告）號: CN113736862A
• 公開（公告）日: 2021-12-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊德平;鄭江花
• 申請（專利權(quán)）人: 上海健康醫(yī)學(xué)院附屬周浦醫(yī)院
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 上海浙晟知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31345
• 代理人: 何文虎

本發(fā)明公開了一種微滴數(shù)字PCR檢測前列腺癌組織中CTHRC1基因含量的方法，屬于CTHRC1基因含量的檢測方法領(lǐng)域。它包括以下步驟：(1)引物與質(zhì)粒準(zhǔn)備：根據(jù)CTHRC1的序列設(shè)計引物，經(jīng)過序列比對分析，針對CTHRC1保守區(qū)設(shè)計引物，5′→3′引物序列為F:CTTCATATGTGGCCGCCAGG；R:AGATGAGCCCCTGGAAAGCA；同時設(shè)計β?actin內(nèi)參引物，5′→3′引物序列為F:CCTGGCACCCAGCACAAT；R:GGGCCGGACTCGTCATAC；利用CTHRC1引物擴(kuò)增的該段目的基因片段構(gòu)建PUC57質(zhì)粒，質(zhì)粒含有3070bp，質(zhì)粒濃度為40ng/μL，通過換算為1.19×10¹⁰copies/μL；(2)酶切PUC57質(zhì)粒；(3)ddPCR檢測。通過電泳驗(yàn)證引物的特異性，引物符合要求；ddPCR檢測CTHRC1的正確度分析表現(xiàn)出很好的線性關(guān)系；ddPCR通過檢測連續(xù)稀釋的質(zhì)粒，得出它檢測CTHRC1的靈敏度高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種微滴數(shù)字PCR檢測前列腺癌組織中CTHRC1基因含量的方法，屬于CTHRC1基因含量的檢測方法技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

前列腺癌是男性泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，其死亡率占男性惡性腫瘤相關(guān)死亡的第三位。隨著我國生活水平，老齡化程度及診斷技術(shù)的提高，前列腺癌的發(fā)病率也在逐年增高。目前TPSA仍是我國前列腺癌經(jīng)濟(jì)、便捷的診斷指標(biāo)，早期TPSA的檢測可降低前列腺癌的病死率。但中國前列腺癌聯(lián)盟(CPCC)研究數(shù)據(jù)顯示，在TPSA 4-10ng/mL時，前列腺穿刺陽性率約26％。同時TPSA水平受炎癥、直腸指診和良性前列腺增生等因素影響，容易產(chǎn)生假陽性情況，因此，臨床迫切需要尋找新的前列腺癌診斷標(biāo)志物，為前列腺癌的早期篩查提供新的指標(biāo)。

CTHRC1是一個28kD的分泌型糖基化蛋白，在人和大鼠中，該基因的氨基酸序列具有92％的同源性。多項(xiàng)研究顯示，在癌癥組織中CTHRC1可參與多種信號通路的調(diào)節(jié)，并促進(jìn)這些癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移，最近已被證明在人胰腺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌和大腸癌中存在高表達(dá)現(xiàn)象。CTHRC1也可作為前列腺癌診斷標(biāo)志物。目前，對CTHRC1基因含量的檢測方法，存在靈敏度不高等問題。因此，設(shè)計一種微滴數(shù)字PCR檢測前列腺癌組織中CTHRC1基因含量的方法，能夠提高對CTHRC1基因含量的檢測靈敏度。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于：提供一種微滴數(shù)字PCR檢測前列腺癌組織中CTHRC1基因含量的方法，它解決了目前對前列腺癌組織中CTHRC1基因含量的檢測靈敏度有待進(jìn)一步提高的問題。

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題采取以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：

微滴數(shù)字PCR檢測前列腺癌組織中CTHRC1基因含量的方法，其特征在于，它包括以下步驟：

(1)引物與質(zhì)粒準(zhǔn)備

根據(jù)CTHRC1的序列設(shè)計引物，經(jīng)過序列比對分析，針對CTHRC1保守區(qū)設(shè)計引物，5′→3′引物序列為F:CTTCATATGTGGCCGCCAGG；R:AGATGAGCCCCTGGAAAGCA；同時設(shè)計β-actin內(nèi)參引物，5′→3′引物序列為F:CCTGGCACCCAGCACAAT；R:GGGCCGGACTCGTCATAC；利用CTHRC1引物擴(kuò)增的該段目的基因片段構(gòu)建PUC57質(zhì)粒，質(zhì)粒含有3070bp，質(zhì)粒濃度為40ng/μL，通過換算為1.19×10¹⁰copies/μL；

(2)酶切PUC57質(zhì)粒

將含有目的基因的PUC57質(zhì)粒與EcoRI試劑按體積比例進(jìn)行混合，其中，EcoRI:10×buffer:PUC57 plasmid:ddH₂O＝1:2:4:13，取總體積為20μL的上述酶切混合物，將混合物放入37℃恒溫金屬浴中孵育2h，然后將混合物在65℃孵育20min，滅活EcoRI酶；

(3)ddPCR檢測