[發明專利]微滴數字PCR檢測前列腺癌組織中CTHRC1基因含量的方法在審
| 申請號： | 202110891825.7 | 申請日： | 2021-08-04 |
| 公開（公告）號： | CN113736862A | 公開（公告）日： | 2021-12-03 |
| 發明（設計）人： | 楊德平;鄭江花 | 申請（專利權）人： | 上海健康醫學院附屬周浦醫院 |
| 主分類號： | C12Q1/6851 | 分類號： | C12Q1/6851;C12N15/11 |
| 代理公司： | 上海浙晟知識產權代理事務所(普通合伙) 31345 | 代理人： | 何文虎 |
| 地址： | 200120 上*** | 國省代碼： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 數字 pcr 檢測 前列腺癌 組織 cthrc1 基因 含量 方法 | ||
1.微滴數字PCR檢測前列腺癌組織中CTHRC1基因含量的方法，其特征在于，它包括以下步驟：
(1)引物與質粒準備
根據CTHRC1的序列設計引物，經過序列比對分析，針對CTHRC1保守區設計引物，5′→3′引物序列為F:CTTCATATGTGGCCGCCAGG；R:AGATGAGCCCCTGGAAAGCA；同時設計β-actin內參引物，5′→3′引物序列為F:CCTGGCACCCAGCACAAT；R:GGGCCGGACTCGTCATAC；利用CTHRC1引物擴增的該段目的基因片段構建PUC57質粒，質粒含有3070bp，質粒濃度為40ng/μL，通過換算為1.19×1010copies/μL；
(2)酶切PUC57質粒
將含有目的基因的PUC57質粒與EcoRI試劑按體積比例進行混合，其中，EcoRI:10×buffer:PUC57 plasmid:ddH2O＝1:2:4:13，取總體積為20μL的上述酶切混合物，將混合物放入37℃恒溫金屬浴中孵育2h，然后將混合物在65℃孵育20min，滅活EcoRI酶；
(3)ddPCR檢測
按照PCR檢測儀器操作指南，反應體系為20μL，其中2x ddPCR Supermix Evagreen 10μL，上下游引物(10μM)各0.4μL，模板3μL，ddH2O 6.2μL；使用微滴生成儀生成微滴，然后用PCR板封口機熱封96孔板，最后使用PCR儀對含有目的基因進行擴增，反應條件為：95℃5min；95℃30s，60℃1min，40個循環；4℃5min；90℃5min；4℃保存；擴增結束后將96孔板放入微滴讀取儀中對擴增產物進行分析，檢測到熒光信號的被記為陽性反應，沒有檢測到熒光的被記為陰性反應，最后通過QuantaSoft分析軟件計算出質粒的絕對濃度。
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