[發(fā)明專利]一種提高乳酰-N-四糖產(chǎn)量的基因工程菌及其生產(chǎn)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110891714.6
• 申請(qǐng)日: 2021-08-04
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113684163B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-07-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張濤;胡苗苗;江波;李夢(mèng)麗
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/70;C12P19/04;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽(yáng)光惠遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 林娟

本發(fā)明公開(kāi)了一種提高乳酰?N?四糖產(chǎn)量的基因工程菌及其生產(chǎn)方法，屬于代謝工程和食品發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過(guò)lgtA和wbgO的外源表達(dá)，組合調(diào)控乳酰?N?四糖合成途徑中g(shù)alE，galT和galK的表達(dá)并敲除大腸桿菌宿主乳酰?N?四糖合成途徑中的lacZ表達(dá)，以及對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基的半乳糖和IPTG添加量進(jìn)行優(yōu)化，從而達(dá)到提高乳酰?N?四糖產(chǎn)量的目的，在搖瓶實(shí)驗(yàn)中，大腸桿菌生產(chǎn)乳酰?N?四糖的能力由0.22g/L提升至4.00g/L，在3L發(fā)酵罐中，乳酰?N?四糖的產(chǎn)量達(dá)到19.80g/L，為乳酰?N?四糖的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種提高乳酰-N-四糖產(chǎn)量的基因工程菌及其生產(chǎn)方法，屬于代謝工程和食品發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

人乳寡糖（human?milk?oligosaccharides，HMOs）是存在于人乳中的一類天然存在的低聚糖，對(duì)嬰兒消化系統(tǒng)的早期發(fā)育，及出生后免疫系統(tǒng)的完善和體內(nèi)生態(tài)平衡的建立發(fā)揮著不可替代的作用。HMOs可耐受嬰兒消化道內(nèi)酶的水解，進(jìn)而抵御胃腸道病原微生物的感染和維持胃腸道微生態(tài)平衡。乳酰-N-四糖（LNT）是人乳寡糖中的一種重要寡糖，能夠增強(qiáng)人體免疫力，調(diào)節(jié)腸道菌群，促進(jìn)細(xì)胞成熟和加速傷口愈合等生物學(xué)功能。鑒于乳酰-N-四糖的重要生物功能和生理活性，已經(jīng)允許添加進(jìn)商品化嬰幼兒配方奶粉中。雖然近年來(lái)對(duì)人乳寡糖各組分的研究不斷深入，但其具體的生物功能還不是很明確，因此獲得足夠量結(jié)構(gòu)均一的人乳寡糖單體來(lái)開(kāi)展它們的生物學(xué)功能研究，以及開(kāi)發(fā)其在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用是現(xiàn)階段研究人員迫切需要解決的問(wèn)題。

目前報(bào)道的乳酰-N-四糖的合成方法主要包括三種，分別是化學(xué)合成、酶法合成和發(fā)酵法合成。化學(xué)合成法存在反應(yīng)步驟復(fù)雜、原材料價(jià)格昂貴等問(wèn)題，造成生產(chǎn)成本較高不利于工業(yè)的大規(guī)模合成，且化學(xué)合成中使用的部分有毒試劑，使產(chǎn)品不宜用于食品添加劑。酶合成法需要昂貴的核苷酸糖作為底物，不利于乳酰-N-四糖的大規(guī)模生產(chǎn)。而生物法可以利用廉價(jià)碳氮源和底物，實(shí)現(xiàn)乳酰N-四糖的合成，且對(duì)環(huán)境不造成影響。因此，通過(guò)生物法制備乳酰-N-四糖受到了越來(lái)越多的關(guān)注。

最近，F(xiàn)lorian等人利用半乳糖作為碳源在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)發(fā)酵合成LNT，產(chǎn)量達(dá)到12.72?g/L（Florian等人，2015），但是該方法使用的半乳糖作為唯一碳源，導(dǎo)致生產(chǎn)成本升高，且最終產(chǎn)量不高，因此，尋求廉價(jià)高產(chǎn)的LNT合成方法來(lái)解決目前微生物生產(chǎn)的瓶頸，打造更高效的生產(chǎn)菌株是非常必要的。

發(fā)明內(nèi)容

[技術(shù)問(wèn)題]

現(xiàn)有技術(shù)不能提供成本低廉且綠色高效生產(chǎn)乳酰-N-四糖的方法。

[技術(shù)方案]

本發(fā)明為了解決現(xiàn)有微生物方法合成的乳酰-N-四糖產(chǎn)量較低的問(wèn)題，提供了一種產(chǎn)乳酰-N-四糖的基因工程菌及其構(gòu)建方法。

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種基因工程菌，所述基因工程菌敲除了β-半乳糖苷酶基因 lacZ，并過(guò)表達(dá)β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶基因 lgtA和β-1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因 wbgO。