[發明專利]一種檢測非洲豬瘟病毒的CDA引物組、試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 202110888873.0
• 申請日: 2021-08-04
• 公開（公告）號: CN113416799B
• 公開（公告）日: 2022-04-26
• 發明（設計）人: 毛瑞;趙月;蔡挺
• 申請（專利權）人: 國科寧波生命與健康產業研究院;中國科學院大學寧波華美醫院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 上海碩力知識產權代理事務所(普通合伙) 31251
• 代理人: 郭桂峰

本發明公開了一種檢測非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)的CDA引物組、試劑盒及其應用。所述CDA引物組為針對非洲豬瘟病毒的保守區片段擴增的引物組，即ASFV?MF?3/ASFV?MR?3；其中，ASFV?MF?3的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，ASFV?MR?3的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。本發明提供的引物組敏感性高、特異性強，由其制成的試劑盒能夠快速、準確的檢測到待測樣品中是否含有非洲豬瘟病毒。另外，本發明所提供的可視化試劑盒將為專業程度不高的養殖場、海關、口岸、社區菜場等地的現場檢測提供極大便利。

技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域，具體涉及一種檢測非洲豬瘟病毒的CDA引物組、試劑盒及其應用。

背景技術

非洲豬瘟病毒(ASFV)可引起一種熱性、急性、高度接觸性傳染病—非洲豬瘟(ASF)。該病傳播快、致死率高，對養豬業危害極大，是最為嚴重的疫病，被世界動物衛生組織(OIE)列為法定報告疫病，也被我國列為一類動物疫病。臨床表現為高熱、皮膚發紺、各臟器的出血和呼吸障礙等。可通過蟲媒傳播和體液傳播，并長期保持活性。另外，被病毒污染的飼料、水源、器具，甚至是農場工作人員和服裝，以及污染農場附近的空氣都是潛在的傳染源。2018年8月3日，我國首次出現非洲豬瘟疫情，隨后病毒很快傳播到全國大部分地區，造成超過千億元的經濟損失，至今仍然對我國生豬養殖造成嚴重威脅。

目前尚無疫苗和有效治療藥物，該疾病的防控唯一有效措施是撲殺，因此對該病毒的快速、特異、高靈敏的診斷極為重要。世界動物衛生組織(OIE)推薦用于檢測ASFV的方法，包括基于RT-PCR的針對病毒基因組特異性核酸序列的擴增信號的檢測，但RT-PCR方法需要在標準生化分析實驗室，使用精密的實時熒光PCR儀，并需要試劑準備、標本制備和PCR擴增檢測三個獨立的試驗區，并不適用于現場快速篩查。天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心等研發機構和企業已成功研制出多種有效診斷ASFV的基于PCR和核酸恒溫擴增技術的診斷試劑。此外，免疫檢測技術所制成的試紙條具有簡便快捷的優勢，但該方法誤檢率高、靈敏度低，難于檢測處于潛伏期的ASFV攜帶者，可能造成疫情的擴散。因此，快速、靈敏、高特異性核酸標志物現場檢測技術的研發，將為非洲豬瘟的防控提供強有力的保障。

基于閉合頸環介導的核酸恒溫擴增技術(Closed Dumbbell mediatedIsothermal Amplification ofnucleic acids，CDA)是由中國科學院大學寧波生命與健康產業研究院開發的新方法，可替代日本LAMP核酸擴增方法(中國專利申請號：202110473121.8)。該方法主要利用2種不同的特異性引物識別靶基因的特定區域，在等溫條件進行擴增反應。與常規基因檢測手段(如PCR等)相比，CDA反應在恒溫水浴箱內便可完成，對儀器設備的要求較低，且操作簡單，非專業人士也可準確地完成，適合于基層醫療機構及地方檢驗檢疫部門。并且，CDA還可以縮短操作時間，提高檢測效率，降低樣品污染的機率，適用于非洲豬瘟病毒的快速診斷。此外，CDA所用關鍵成環引物約為30bp，較LAMP(40bp)短，這將節省檢測成本。

發明內容

本發明的目的是，提供一種檢測非洲豬瘟病毒的CDA引物組、試劑盒及其應用。

本發明為實現上述目的所采用的技術方案如下：

本發明通過對表1所述的4對引物組進行篩選，獲得對非洲豬瘟病毒檢測效果最優的引物組為ASFV-MF-3/ASFV-MR-3。

表1

本發明還提供一種檢測非洲豬瘟病毒的試劑盒，所述試劑盒包括上述最優的CDA引物組，即ASFV-MF-3和ASFV-MR-3。

作為優選實施方案，所述CDA引物組，引物ASFV-MF和ASFV-MR在反應體系中的濃度均為1～2μM。