[發明專利]消除大腸桿菌藥物耐藥性的中藥組方及其篩選方法與應用

在審

• 申請號: 202110887766.6
• 申請日: 2021-08-03
• 公開（公告）號: CN113604535A
• 公開（公告）日: 2021-11-05
• 發明（設計）人: 張永英;鐘翠紅;王芝超;石玉祥;郝賀;曠年玲;左麗
• 申請（專利權）人: 河北工程大學
• 主分類號: C12Q1/18
• 分類號: C12Q1/18;C12Q1/6851;G01N27/447;A61K36/734;A61K36/718;A61P31/04;A61K31/546
• 代理公司: 北京集智東方知識產權代理有限公司 11578
• 代理人: 吳倩

本發明提供了一種組成消除耐藥中藥組方及篩選方法，試驗選擇4株多重耐藥大腸桿菌作為研究對象，分別以亞抑菌濃度(1/2MIC)中藥與4株菌分別共培養72h。然后采用凝膠電泳法、雙紙片法、熒光定量PCR和生物膜陽性篩選方法檢測細菌培養物，根據體外消除細菌耐藥效果，確定消除耐藥效果較好單味中藥組成組方；再通過動物試驗，檢查各組心肝組織病理學變化，并統計各組治愈率、有效率、死亡率，并驗證組方體內消除大腸桿菌耐藥的效果。本發明組方山楂黃連組方+抗生素效果優于傳統組方三黃湯，說明利用此種方法組成的組方治療效果優于根據中藥辯證論治組成的傳統組方。

技術領域

本發明屬于中藥制劑技術領域，具體涉及消除大腸桿菌藥物耐藥性的中藥組方及其篩選方法。

背景技術

近年來，大腸桿菌病在國內養禽場廣泛流行，發病率和死亡率居高不下，嚴重威脅著養禽業發展，造成巨大經濟損失。長期以來，在治療該病過程中，抗菌藥物發揮極其重要作用。但抗菌藥物廣泛、持續和不合理使用，加大耐藥大腸桿菌尤其是產超廣譜β-內酰胺酶大腸桿菌的產生和擴散，造成藥物治療效果不理想，已成為阻礙養禽業發展的難題之一。由此可見，細菌產生耐藥性是導致上述結果的主要原因。因此降低大腸桿菌耐藥性，恢復對部分或全部抗生素的敏感性對于臨床治療細菌感染及防止細菌耐藥性傳播具有重要意義。降低細菌耐藥性有多種途徑，其中低毒、成本低廉的中藥和天然植物備而受關注，因此，利用中藥消除雞源大腸桿菌耐藥性成為一個可深入探索的研究方向。

中藥通過消除R質粒、抑制ESBLs活性、影響細菌生長速度和蛋白表達量、抑制主動外排系統和細菌生物膜形成等作用機制，使細菌恢復對抗菌素敏感性。研究表明，中藥可改變大腸桿菌特異性耐藥基因和非特異性耐藥基因的轉錄和翻譯水平，從根本上逆轉細菌的耐藥性。然而細菌多重耐藥機制證明多重耐藥是由多種因素決定的，單一的逆轉制劑不可能抑制所有的耐藥機制，多種逆轉制劑聯合應用針對多重耐藥機制可能更有效。通過這種策略，即組合單體或復合天然提取物可以發揮協同對抗作用并且影響藥物多靶點。目前中藥配伍遵循中藥辯證論治結合中獸醫傳統理論，而本發明針對不同耐藥機制，可全方位、多角度的消除細菌多重耐藥性，延長抗生素使用壽命。

發明內容

本發明的目的是為了解決現有技術中存在的缺點，提供一種安全有效地用來消除對雞源大腸桿菌β-內酰胺類藥物耐藥的中藥組合物及其篩選方法。

本發明采用的技術方案為：一種消除大腸桿菌藥物耐藥性的中藥組方篩選方法，包括以下步驟：

A、根據消除大腸桿菌耐藥機制篩選單味中藥，所述耐藥機制主要包括R質粒介導、產生ESBLs、通過主動外排系統和形成生物膜；

B、采用凝膠電泳方法篩選消除R質粒的單味中藥；

C、利用雙紙片法篩選抑制ESBLs活性的單味中藥；

D、利用熒光定量PCR方法篩選降低外排系統基因Acra-mRNA、Acrb-mRNA表達量的單味中藥；

E、利用生物膜陽性篩選方法，篩選出降低生物膜黏附性的單味中藥；

F、將步驟B-E中篩選出的單味中藥組成中藥組合物。

進一步地，所述篩選方法還包括：

A-1、中藥水提物制備：將單味中藥浸泡30min，文火熬制2次，合并濃縮、過濾除菌，濃度為1g/mL以生藥計，得到單味中藥水提物；

A-2、大腸桿菌菌液制備：將冷凍保存菌液接種于LB液體培養基中，37℃培養過夜，將活化菌液劃線接種于麥康凱瓊脂平板，37℃倒置培養過夜，挑取單菌落接種于LB液體培養基中，37℃培養過夜，得到大腸桿菌液。

一種消除大腸桿菌藥物耐藥性的中藥組方，所述中藥組合物為山楂1份和黃連1份，所述中藥組合物與抗生素聯合使用，所述抗生素為頭孢噻肟，所述抗生素與中藥組合物的重量份數比為(2～5)：10。