[發明專利]一種普卡那肽的制備方法

在審

• 申請號: 202110886927.X
• 申請日: 2021-08-03
• 公開（公告）號: CN113801197A
• 公開（公告）日: 2021-12-17
• 發明（設計）人: 劉寶生;張巍;李湘;徐琪
• 申請（專利權）人: 中肽生化有限公司
• 主分類號: C07K7/08
• 分類號: C07K7/08;C07K1/20;C07K1/06;C07K1/04
• 代理公司: 浙江英普律師事務所 33238
• 代理人: 陳俊志

本發明公開了一種普卡那肽的固相片段合成方法，屬于多肽合成技術領域，所述方法使用固相合成法逐個連接4?16片段，然后將1?3片段連接到4?16片段固相樹脂上得到全肽樹脂，酸解同步進行脫側鏈保護基及切肽，得到普卡那肽粗品，經純化、凍干得到普卡那肽純品。本發明采用了保護氨基酸片段Fmoc?Asn(Trt)?Asp(OtBu)?Glu(OtBu)?OH為原料，減少了雜質的產生，縮短了合成周期，所得粗品純度高，易于純化，具有較好的應用前景。

技術領域：本發明涉及多肽藥物制備領域，尤其是涉及一種固相法制備普卡那肽的方法

背景技術：普卡那肽(Plecanatide)是尿鳥苷蛋白(uroguanylin，UGN)的類似物,具有促尿鈉排泄的鳥苷酸環化酶受體激動藥的作用,能調節胃腸道中的酸堿離子,誘導液體轉運進入胃腸道,增加胃腸道的蠕動，用于治療成人慢性特發性便秘(chronicidiopathic constipation,CIC)、便秘型腸易激綜合征(constipation-predominantirritable bowel syndrome,IBS-C)。

普卡那肽是一種比較難制備的16肽，序列中含有雙二硫鍵且具有獨特的空間纏繞結構，固相連接過程中極易發生縮聚，導致合成困難。專利CN105764916A報道了固液相結合的方法合成普卡那肽，首先固相合成1-6片段1，固相合成7-14片段2，液相合成15-16片段3，然后按順序在液相中連接片段2,3，再連接片段1，得到普卡那肽線性肽。該方法工藝繁瑣，中間體多，操作復雜，生產成本高。專利CN104628827B報道了逐步法合成普卡那肽的方法，其中Cys采用了StBu,Mmt,Acm保護，且在固相樹脂上進行氧化。該方法Cys保護基的脫除難度較大。且在樹脂上氧化，反應中控難度較大，無法保證氧化完全。專利CN108864254A報道了固相合成肽樹脂，4,12位Cys用StBu保護；7,15位氨基酸用3-Cl-Ala代替Cys氨基酸。該方法在3-Cl-Ala轉化成Cys的步驟中，存在轉化不完全的風險，不利于大規模生產。專利CN107383170A報道了固相合成普卡那肽的方法，采用空氣自然氧化的方法構建兩對二硫鍵。由于普卡那肽有兩對二硫鍵，自然氧化可參產生兩種錯搭肽，拓撲異構以及多聚體，不利于大規模生產。專利CN1080003222A報道了固相合成普卡那肽的方法，首先液相逐步合成全保護1-6片段，再固相合成7-16片段，再用酶促法將6肽片段連接到肽樹脂上。該法逐步法合成1-6難度太大，不適用于工業化生產。

普卡那肽是一款市場需求量達到百公斤級別的多肽口服原料藥，上述專利雖然具有一定技術上的新穎性，但是規模化生產，難度較大。在普卡那肽的研究中，我們發現普卡那肽序列的特殊性，導致其易發生縮聚現象，屬于“困難肽”，常規方法連接時會發生偶聯困難，因此需要加入具有大位阻保護基的氨基酸，改變其二級結構，緩解縮聚現象。此外，在固相連接最后三個氨基酸時發現，容易產生β-Asp,Assu，D-Asp，D-Asn，以及缺失肽等雜質，而分析原研制劑發現，這些雜質控制在極低水平，需要采取適當方法解決上述雜質含量較高的問題。

發明內容：

為解決上述問題，開發一種易于合成、雜質含量少的普卡那肽制備方法十分必要。為實現本發明的目的，本發明采用如下技術方案：

一種普卡那肽的制備方法，包括：

步驟1)將Fmoc-Leu-OH連接至固相樹脂上。

步驟2)按照序列利用固相合成法逐個連接4-16片段，得到H-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(Acm)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(Trt)-Thr(tBu)-(Hmb)Gly-Cys(Acm)-Leu-Wang樹脂。