[發(fā)明專利]評估USH2A外顯子13剔除效率的MINI-REP基因及其表達載體和應用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202110884031.8
• 申請日: 2021-08-03
• 公開（公告）號: CN115704031A
• 公開（公告）日: 2023-02-17
• 發(fā)明（設計）人: 梁峻彬;歐家裕;徐輝
• 申請（專利權）人: 廣州瑞風生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/85;C12N15/65;C12N5/10;G01N21/64
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司 44100
• 代理人: 李海恬

1.一種評估USH2A外顯子13剔除效率的MINI-REP基因，其特征在于，包括報告基因和小基因，所述報告基因為行使報告功能的基因，所述小基因包括依次連接的USH2A內含子12、外顯子13和內含子13的基因；所述小基因插入所述報告基因，將所述報告基因分割成斷裂報告基因，所述斷裂報告基因單獨表達均不發(fā)揮報告功能，串聯(lián)完整表達則發(fā)揮報告功能。

2.根據權利要求1所述的MINI-REP基因，其特征在于，所述內含子12的基因由內含子12的5’端長度為50-200bp的基因片段和3’端長度為200bp-1700bp的基因片段按照5’-3’順序串聯(lián)得到，所述內含子13的基因由內含子13的5’端長度為200bp-1700bp的基因片段和3’端長度為50-200bp的基因片段按照5’-3’順序串聯(lián)得到。

3.根據權利要求2所述的MINI-REP基因，其特征在于，所述內含子12的基因5’段片段長度為192-204bp，3’端片段長度為490-1611bp，所述內含子13的基因5’段片段長度為706-1599bp，3’端片段長度為216bp。

4.根據權利要求3所述的MINI-REP基因，其特征在于，所述內含子12的基因包括以下區(qū)域及相似性≥90％的序列：內含子12的剪接沉默子ISS、外顯子13的剪接的分支位點BP、外顯子13的剪接受體SA、外顯子13的剪接供體SD或外顯子13的剪接增強子ESE；

所述內含子13的基因包括以下區(qū)域及相似性≥90％的序列：內含子13的剪接增強子ISE或內含子13的聚嘧啶束。

5.根據權利要求1所述的MINI-REP基因，其特征在于，所述報告基因選自：熒光蛋白基因或酶標記基因。

6.根據權利要求5所述的MINI-REP基因，其特征在于，所述報告基因為綠色熒光基因EGFP。

7.根據權利要求1-6中任一項所述的MINI-REP基因，其特征在于，將所述小基因插入所述報告基因內連續(xù)2個G堿基之間。

8.根據權利要求7所述的MINI-REP基因，其特征在于，將所述小基因插入綠色熒光基因EGFP序列AGGT的2個G堿基之間。

9.根據權利要求1所述的MINI-REP基因，其特征在于，所述外顯子13的基因包括以下致病突變中的至少一種：c.2802TG(p.Cys934Trp)、c.2299delG(p.E767SfsX21)、c.2276GT(p.C759F)、c.2522CA(p.S841Y)、c.2242CT(p.Gln748X)、c.2541CA(C847X)、c.2761delC(Leu921fs)和c.2776CT(p.R926C)、c.2209CT、c.2310delA、c.2391_2392deITG、c.2431AT、c.2431_2432delAA、c.2440CT、c.2525dup、c.2610CA、c.2755CT、c.2176TC、c.2236CG、c.2296TC和c.2332GT。

10.根據權利要求9所述的MINI-REP基因，其特征在于，所述外顯子13的致病突變包括c.2802TG或c.2299delG。

11.根據權利要求10所述的MINI-REP基因，其特征在于，所述外顯子13的致病突變?yōu)閏.2802TG。

12.一種表達權利要求1-11任一項所述MINI-REP基因的表達載體。

13.一種包括權利要求12所述表達載體的報告基因評估細胞，其特征在于，該評估細胞由所述表達載體瞬時轉染和/或穩(wěn)定轉染宿主細胞構建得到。