[發明專利]一種伊枯草菌素抑菌活性的定量測定方法

在審

• 申請號: 202110883875.0
• 申請日: 2021-08-03
• 公開（公告）號: CN113430245A
• 公開（公告）日: 2021-09-24
• 發明（設計）人: 溫劉發
• 申請（專利權）人: 廣州百仕肽生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/18
• 分類號: C12Q1/18;C12Q1/04
• 代理公司: 廣州晟策知識產權代理事務所(普通合伙) 44709
• 代理人: 王靜

本發明屬于生物活性肽檢測技術領域，具體涉及一種伊枯草菌素抑菌活性的定量測定方法，包括：對待檢測樣品進行對應的處理，得到伊枯草菌素樣液；制備對數期指示菌；制備含指示菌的MH培養平板；肽液點樣和細菌培養；結果計算。本發明的伊枯草菌素抑菌活性的定量測定方法，可以對制備/純化伊枯草菌素及其產品的各個環節得到的樣品中的伊枯草菌素的抑菌活性定量測定計算，實現了伊枯草菌素生產過程中各個環節以及各種形式的產品的伊枯草菌素活性的統一監控，只需要一套實驗設備及流程，節省了質量監控的成本。本發明的伊枯草菌素抑菌活性的定量測定方法，能快速準確地得出結果，操作簡便、計算步驟簡潔，非常適合在規?；a中應用。

技術領域

本發明屬于生物活性肽檢測技術領域，具體涉及一種伊枯草菌素抑菌活性的定量測定方法。

背景技術

伊枯草菌素為一種肽類抗菌物質?？咕幕螂念惪股貫樯矬w內穩定存在或在創傷感染后誘導產生的一類活性分子。其分子量較抗生素大,分子結構復雜?？咕木哂兴苄院?無免疫原性,抗菌性廣譜等特點，并對腫瘤細胞、病毒、真菌和原蟲等有殺傷作用,是一類令致病菌很難產生耐藥性的藥物，在替代傳統抗生素藥方面具有很大潛力。

有關抗菌肽的研究均集中于提取、分離純化及基因表達等方面。然而,在抗菌肽分離純化過程中,如何監控其活性是最重要的。因此,在抗菌肽分離的每一步均要跟蹤測定抗菌肽的活性,否則就失去了分離、純化的意義。測定抗菌肽活性的方法有很多種,其中定性方法主要是瓊脂擴散法，包括濾紙片法、平板打孔法和牛津杯法,三者都是通過抑菌圈的大小來直觀反映其抑菌活性；定量方法主要是酶標比濁法和活菌計數法。但由于各種方法均有自身特質和明顯利弊，目前無法統一抗菌肽活力計算標準，這就導致了抗菌肽的生產過程中對質量的評價無法統一。

發明內容

鑒于此，有必要針對上述問題提供一種伊枯草菌素抑菌活性的定量測定方法。

本發明是通過以下技術方案實現的：

一種伊枯草菌素抑菌活性的定量測定方法，包括：

對待檢測樣品進行對應的處理，得到伊枯草菌素樣液；

制備對數期指示菌；

制備含指示菌的MH培養平板；

肽液點樣和細菌培養；

結果計算。

需要說明的是：所述“對待檢測樣品進行對應的處理，得到伊枯草菌素樣液”、“制備對數期指示菌”和“制備含指示菌的MH培養平板”三項操作并無先后順序，只需要在“肽液點樣和細菌培養”操作之前將所述三項完成即可。

進一步的，所述“對待檢測樣品進行對應的處理”中的待檢測樣品包括：滅菌前的發酵液、滅菌后的發酵液、伊枯草菌素發酵液濃縮膏、伊枯草菌素初級預混劑、含伊枯草菌素的產品等中的至少一種。

進一步的，所述“對待檢測樣品進行對應的處理”的操作包括以下情況中的至少一種處理方式：

(1)對于滅菌前的發酵液，先用無菌水稀釋至少2倍，離心(3000～4000rpm，10～20分鐘)，至上清液澄清后，吸取上清液進行點樣操作。

(2)對于滅菌后的發酵液，直接離心(3000～4000rpm，10～20分鐘)，至上清液澄清，吸取上清液10μl進行點樣操作。

(3)對于伊枯草菌素發酵液濃縮膏，先用無菌水稀釋10倍，離心(3000～4000rpm，10～20分鐘)，至上清液澄清，再吸取上清液10μl進行點樣操作。此處理方式中，稀釋倍數與濃縮倍數有關，此處采用的濃縮膏是滅菌液經10倍濃縮后得到的，故此處稀釋10倍，如濃縮倍數為其他數值，此處的稀釋倍數對應其濃縮倍數的其他數值。