[發明專利]一種伊枯草菌素抑菌活性的定量測定方法

在審

• 申請號: 202110883875.0
• 申請日: 2021-08-03
• 公開（公告）號: CN113430245A
• 公開（公告）日: 2021-09-24
• 發明（設計）人: 溫劉發
• 申請（專利權）人: 廣州百仕肽生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/18
• 分類號: C12Q1/18;C12Q1/04
• 代理公司: 廣州晟策知識產權代理事務所(普通合伙) 44709
• 代理人: 王靜

1.一種伊枯草菌素抑菌活性的定量測定方法，其特征在于，所述的伊枯草菌素抑菌活性的定量測定方法包括：

對待檢測樣品進行對應的處理，得到伊枯草菌素樣液；

制備對數期指示菌；

制備含指示菌的MH培養平板；

肽液點樣和細菌培養；

結果計算。

2.根據權利要求1所述的伊枯草菌素抑菌活性的定量測定方法，其特征在于，所述“對待檢測樣品進行對應的處理”中的待檢測樣品包括：滅菌前的發酵液、滅菌后的發酵液、伊枯草菌素發酵液濃縮膏、伊枯草菌素初級預混劑或含伊枯草菌素的產品中的至少一種。

3.根據權利要求2所述的伊枯草菌素抑菌活性的定量測定方法，其特征在于，所述“對待檢測樣品進行對應的處理”的操作包括以下情況(1)至(5)中的至少一種處理方式：

(1)對于滅菌前的發酵液，先將發酵液稀釋至少2倍，離心后吸取上清液進行點樣操作；

(2)對于滅菌后的發酵液，直接離心，吸取上清液進行點樣操作；

(3)對于伊枯草菌素發酵液濃縮膏，先將濃縮膏按照濃縮倍數稀釋，離心，再吸取上清液進行點樣操作；

(4)對于伊枯草菌素初級預混劑，先將預混劑稀釋至少2倍，再稱取稀釋后的樣品，加入濃度為65％的酒精溶液溶解樣品，超聲處理后離心，吸取上清液進行點樣操作；

(5)對于含伊枯草菌素的產品，直接稱取樣品，加入濃度為65％的酒精溶液溶解樣品，超聲處理后離心，吸取上清液進行點樣操作。

4.根據權利要求3所述的伊枯草菌素抑菌活性的定量測定方法，其特征在于，情況(4)中所述“稀釋后的樣品”與加入的“濃度為65％的酒精溶液”的質量體積比為：稀釋后的樣品(g)：濃度為65％的酒精溶液(L)＝62.5：1。

5.根據權利要求3所述的伊枯草菌素抑菌活性的定量測定方法，其特征在于，情況(5)中所述“伊枯草菌素樣品”與加入的“濃度為65％的酒精溶液”的質量體積比為：伊枯草菌素樣品(g)：濃度為65％的酒精溶液(L)＝125：1。

6.根據權利要求1所述的伊枯草菌素抑菌活性的定量測定方法，其特征在于，所述“制備對數期指示菌”的操作包括：

將耐藥的大腸桿菌突變株K₁₂D₃₁菌種劃線于平板培養基上，培養至其上生長有明顯的菌落；挑一菌落于含抗生素50μg/ml的肉湯培養基中，置于恒溫搖床振蕩培養，培養至其OD_600nm＝0.5。

7.根據權利要求1所述的伊枯草菌素抑菌活性的定量測定方法，其特征在于，所述“制備含指示菌的MH培養平板”的操作包括：

向熔融的MH培養基中加入對數期指示菌液，混勻；取含菌培養基倒入培養皿中，使固定培養基厚度達4.22mm；培養基凝固后，將平板分區，并在平板培養基的每區上均勻分布地打孔并標號。

8.根據權利要求7所述的伊枯草菌素抑菌活性的定量測定方法，其特征在于，所述“向熔融的MH培養基中加入對數期指示菌液”的加入量為：500μl菌液/100ml培養基。

9.根據權利要求1所述的伊枯草菌素抑菌活性的定量測定方法，其特征在于，所述“肽液點樣和細菌培養”操作包括：

每一個待測樣液，各吸取3份，每份10μl，分別點樣于含指示菌的MH培養平板的每區中對應標號的孔中，并立即于4℃靜置6h，后轉移到37℃培養箱中培養24h；測定并記錄每一個抑菌圈的直徑。

10.根據權利要求1所述的伊枯草菌素抑菌活性的定量測定方法，其特征在于，所述“結果計算”的計算方法包括以下(1)至(5)中的至少一種：

(1)待測樣品為滅菌前的發酵液時，伊枯草菌素的抑菌活性按(a)式計算：A_發酵液(AU/ml)＝稀釋倍數×1500e^Y；其中Y＝0.015D²，D＝抑菌圈直徑(mm)；

(2)待測樣品為滅菌后的發酵液時，伊枯草菌素的抑菌活性按(b)式計算：A_發酵液(AU/ml)＝1500e^Y；其中Y＝0.015D²，D＝抑菌圈直徑(mm)；

(3)待測樣品為伊枯草菌素發酵液濃縮膏時，伊枯草菌素的抑菌活性按(c)式計算：A_濃縮膏(AU/ml)＝稀釋倍數×1500e^Y；其中Y＝0.015D²，D＝抑菌圈直徑(mm)；

(4)待測樣品為伊枯草菌素初級預混劑時，伊枯草菌素的抑菌活性按(d)式計算：A_{白炭黑預混肽}(AU/g)＝(稀釋倍數×4/0.25)×1500e^Y；其中Y＝0.015D²，D＝抑菌圈直徑(mm)；

(5)待測樣品為含伊枯草菌素的產品時，伊枯草菌素的抑菌活性按(e)式計算：A_{伊枯草菌素產品}(AU/g)＝(2/0.25)×1500e^Y；其中Y＝0.015D²，D＝抑菌圈直徑(mm)。