[發(fā)明專利]一種在臨床血液樣本中快速檢測擬態(tài)弧菌的方法

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• 申請日: 2021-07-31
• 公開（公告）號: CN113637779A
• 公開（公告）日: 2021-11-12
• 發(fā)明（設計）人: 朱鵬;張順;蔡挺
• 申請（專利權）人: 中國科學院大學寧波華美醫(yī)院
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6851;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 杭州橙知果專利代理事務所(特殊普通合伙) 33261
• 代理人: 杜放

本發(fā)明公開了一種在臨床血液樣本中快速檢測擬態(tài)弧菌的方法，包括以下步驟:S1：獲取待測血液樣本，并提取DNA模板；S2：利用引物及探針的組合進行實時熒光RPA檢測，根據(jù)擴增的結果判斷生物樣品是否感染擬態(tài)弧菌；其中引物和探針以擬態(tài)弧菌中相關的毒力因子vmhA基因為靶點進行設計。本發(fā)明具有極高的特異性和靈敏度，在較高濃度下(3.5×10⁶cfu/mL)實時熒光RPA法可以在最短3.32min獲得陽性結果。本發(fā)明實時熒光RPA方法對血漿樣本中的抑制成分具有很好的耐受性，可以對簡單的煮沸法處理的臨床血漿樣本進行直接擴增，縮短了整個檢測時間。另外，本發(fā)明實時RPA方法可以和便攜式設備相結合，在擬態(tài)弧菌暴發(fā)現(xiàn)場的臨床診斷中，將是監(jiān)測擬態(tài)弧菌感染的一種非常有用的方法。

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域，尤其是涉及一種在臨床血液樣本中快速檢測擬態(tài)弧菌的方法。

背景技術

擬態(tài)弧菌(Vibrio mimicus)作為弧菌屬中的主要致病菌之一，廣泛分布于包括淡水、海水等自然環(huán)境中以及與之接觸的野生或養(yǎng)殖水生動物體內，常常導致人和水生動物的患病。因其形態(tài)、生理生化特征、患病的臨床變現(xiàn)以及基因組特性均與霍亂弧菌(Vibriocholera)極為相似，早期曾被認為是同一種病原菌。在快速擴增繁殖過程，擬態(tài)弧菌能產生包括溶血素、腸毒素、包外金屬蛋白酶在內的多種毒力因子。因此，人們在食用被擬態(tài)弧菌感染的水產品后往往會引起細菌性腸炎，導致急性霍亂樣腹瀉(cholera-like diarrhea)或痢疾樣腹瀉(dysentery-like diarrhea)，嚴重的情況下會導致死亡。近年來，擬態(tài)弧菌引起的食物中毒事件在全世界時有發(fā)生。我國多地也曾出現(xiàn)過因擬態(tài)弧菌感染引起的食物中毒事件。在這些擬態(tài)弧菌臨床感染病例中，研究者已多次分離出一種與霍亂弧菌產生的霍亂毒素(CT)具有相同的免疫生物學反應的不耐熱腸毒素，而且近期有報道稱，從我國的淡水鯰魚中分離到一株毒性更強，傳染性更高的擬態(tài)弧菌，這表明該菌隨著地域環(huán)境的變化，其致病性有突變增強的趨勢。雖然與擬態(tài)弧菌相關的疾病暴發(fā)通常是零星的，但目前絕對有必要重新考慮該菌在人與環(huán)境中的感染的風險。早期和快速診斷是管理和預防擬態(tài)弧菌感染的關鍵。因此，需盡快建立病原菌的快速、簡便、靈敏的檢測方法，實現(xiàn)對該病原菌在臨床特別是在設備相對落后的基層社區(qū)醫(yī)院的快速檢測，這對于提升我們的公共衛(wèi)生安全保障能力，提高弧菌感染性疾病應急響應水平有著極為重要的意義。

目前，對于擬態(tài)弧菌的檢測，傳統(tǒng)的生理生化實驗并結合顯微鏡觀察，仍然是金標準。但該方法繁瑣、耗時且往往需要實驗人員具備豐富的個人經驗。同時由于擬態(tài)弧菌在形態(tài)和多種生化指標上與霍亂弧菌極為相似，常常導致誤判。隨著生物技術的不斷發(fā)展，一些科研人員成功將PCR技術應用于擬態(tài)弧菌的檢測和分析。但由于PCR技術本身固有的缺點，如需要整套的用于核實擴增檢測的儀器設備、一定的實驗條件以及操作程序復雜等，大大限制了其在擬態(tài)弧菌的實際診斷檢測(尤其是快速的基層現(xiàn)場診斷檢測)中的應用。近年來，等溫核酸擴增技術出現(xiàn)突破了原有PCR擴增的溫控條件，降低了核酸擴增對于設備的要求，因此得到了迅速的發(fā)展。這其中重組酶聚合酶介導核酸擴增技術(RPA)因其在反應條件及時間的優(yōu)勢格外引人關注。

發(fā)明內容

本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術的不足，建立一種基于實時RPA的以擬態(tài)弧菌中相關的毒力因子vmhA基因為靶點的擬態(tài)弧菌快速檢測方法。在此基礎上，對實時RPA法進行了優(yōu)化，并通過對人工感染的血液樣品的檢測評價了該方法在實際應用中的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案：一種在臨床血液樣本中快速檢測擬態(tài)弧菌的方法，包括以下步驟:

S1：獲取待測血液樣本，并提取DNA模板；

S2：利用引物及探針的組合進行實時熒光RPA檢測，根據(jù)擴增的結果判斷生物樣品是否感染擬態(tài)弧菌；其中引物和探針以擬態(tài)弧菌中相關的毒力因子vmhA基因為靶點進行設計。