[發(fā)明專利]一種在臨床血液樣本中快速檢測(cè)擬態(tài)弧菌的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110876719.1
• 申請(qǐng)日: 2021-07-31
• 公開（公告）號(hào): CN113637779A
• 公開（公告）日: 2021-11-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱鵬;張順;蔡挺
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)寧波華美醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12Q1/689
• 分類號(hào): C12Q1/689;C12Q1/6851;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 杭州橙知果專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 33261
• 代理人: 杜放

1.一種在臨床血液樣本中快速檢測(cè)擬態(tài)弧菌的方法，其特征在于,包括以下步驟:

S1：獲取待測(cè)血液樣本，并提取DNA模板；

S2：利用引物及探針的組合進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RPA檢測(cè)，根據(jù)擴(kuò)增的結(jié)果判斷生物樣品是否感染擬態(tài)弧菌；其中引物和探針以擬態(tài)弧菌中相關(guān)的毒力因子vmhA基因?yàn)榘悬c(diǎn)進(jìn)行設(shè)計(jì)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種在臨床血液樣本中快速檢測(cè)擬態(tài)弧菌的方法，其特征在于，所述S2中的引物包括vmhR-F1和vmhR-R1，其中，從5’至3’方向，所述vmhR-F1的序列為TAACCCAAGGGAAAGTGAATCAGCAGCGAGTA，所述vmhR-R1的序列ATGCTACCGCCCGTACCACCAACCAACAACTC。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種在臨床血液樣本中快速檢測(cè)擬態(tài)弧菌的方法，其特征在于，所述S2中的引物包括vmhR-F2和vmhR-R2，其中，從5’至3’方向，所述vmhR-F2的序列為AACCCAAGGGAAAGTGAATCAGCAGCGAGTA，所述vmhR-R2的序列為ACCGCCCGTACCACCAACCAACAATC。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種在臨床血液樣本中快速檢測(cè)擬態(tài)弧菌的方法，其特征在于，所述S2中的引物包括vmhR-F3和vmhR-R3，其中，從5’至3’方向，所述vmhR-F3的序列為AACCCAAGGGAAAGTGAATCAGCAGCGAGTA，所述vmhR-R3的序列為GCTACCGCCCGTACCACCAACCAACAACTC。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種在臨床血液樣本中快速檢測(cè)擬態(tài)弧菌的方法，其特征在于，從5’至3’方向，所述S2中探針的序列為CAACTCTACGTACGTGCAGGTGCCGCCA[FAM-dT]^aT[THF]^bA[BHQ-dT]^dGCTTTAGGAACTG(C3-spacer)^d，其中FAM-dT為6羧基熒光素標(biāo)記的胸腺嘧啶脫氧核苷酸，THF為四氫呋喃間隔，BHQ1-dT為淬滅基團(tuán)，C3-spacer為C3間隔臂修飾的阻斷基團(tuán)。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種在臨床血液樣本中快速檢測(cè)擬態(tài)弧菌的方法，其特征在于，所述S2中引物和探針設(shè)計(jì)的具體步驟為：

S21：獲取擬態(tài)弧菌vmhA基因序列；

S22：通過(guò)在線比對(duì)軟件進(jìn)行同源性比對(duì)，尋找同源性保守區(qū)域，確定擴(kuò)增的目標(biāo)基因序列；

S23：根據(jù)TwistAmp DNA擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)手冊(cè)設(shè)計(jì)針對(duì)保守區(qū)域的引物和探針。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種在臨床血液樣本中快速檢測(cè)擬態(tài)弧菌的方法，其特征在于，所述實(shí)時(shí)熒光RPA的反應(yīng)體系包括：14.75μL緩沖液、3.6μL去離子水、上下游引物各1.05μL、1.25μl Mg²⁺、0.3μL探針及3μLDNA模板，其中上下游引物的濃度分別為10μM，探針的濃度為10μM。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種在臨床血液樣本中快速檢測(cè)擬態(tài)弧菌的方法，其特征在于，所述S1中提取DNA模板的方法為試劑盒提取法或煮沸法。