[發明專利]一種腦微血管內皮細胞提取純化方法

有效

• 申請號: 202110876479.5
• 申請日: 2021-07-30
• 公開（公告）號: CN113564100B
• 公開（公告）日: 2023-05-05
• 發明（設計）人: 黃志新;劉新通;盧海克
• 申請（專利權）人: 廣東省第二人民醫院（廣東省衛生應急醫院）
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫

本發明公開了一種腦微血管內皮細胞提取純化方法，涉及細胞純化的技術領域。其提取純化方法，包括以下步驟：S1、粗提小鼠腦組織中的腦微血管內皮細胞；S2、對S1處理后的腦微血管內皮細胞混合物進行第一次CD31免疫磁珠分選以純化；S3、對S2處理后的腦微血管內皮細胞進行第二次CD31免疫磁珠分選以純化，即得純化后的腦微血管內皮細胞。本申請采用CD31磁珠二次分選的方式，降低對腦微血管內皮細胞活性的損傷，分離純化效率高，操作步驟相對簡單，可以獲得高純度、高產量及高活性的腦微血管內皮細胞。

技術領域

本發明涉及細胞提取的技術領域，尤其涉及一種腦微血管內皮細胞提取純化方法。

背景技術

腦微血管內皮細胞(Brainmicrovascularendothelialcells)，簡稱BMECs，是構成血腦屏障的主要成分，是各種生理、病理因素作用的靶細胞，可以通過選擇性雙向跨細胞膜轉運系統以及細胞間的緊密連接將腦組織與血液分開，限制大多數極性分子和蛋白質進入腦組織。其培養精于20世紀70年代末，也是研究血-腦屏障及腦神經科多種疾病的一個重要模型，分離純化BMECs為研究腦內皮細胞的生理和病理特性提供了有效的技術支持。BMECs細胞具有很多自身特性，如細胞活性低，分離的細胞容易受到成纖維細胞、平滑肌等雜細胞污染等等問題導致產量低，BMECs的分離培養，關鍵在于腦微血管段的分離和內皮細胞的獲取、純化。

目前應用的方法主要有非酶法和酶消化法兩種，非酶法應用較多的主要有：采用勻漿器勻漿或直接將組織切碎至1～2mm。酶消化法中BMECs大多是在剪碎或使其勻漿化后與蛋白水解酶共培養不同的時間(酶消化法)后分離出來。目前這些方法存在著微血管活性損傷的問題，此外，提取步驟繁瑣、費時、費力，分離的細胞容易受到成纖維細胞、平滑肌等雜細胞污染等等問題導致產量低，不能夠有效獲得高產量、高純度及高活力的BMECs。

發明內容

本發明提供了一種腦微血管內皮細胞提取純化方法，為了解決目前的純化技術存在產量低、活性和純度低的缺陷，發明人通過反復試驗和改進，采用CD31免疫磁珠多次分選的方式，降低對腦微血管內皮細胞的活性影響，分離效率高，成功摸索得到相對簡單，且高產量、高純度及高活力的純化方法，具有穩定的可重復性。

為了解決上述技術問題，本發明實施例提供了一種腦微血管內皮細胞提取純化方法，具體包括以下步驟：

S1、粗提小鼠腦組織中的腦微血管內皮細胞；

S2、對S1處理后的腦微血管內皮細胞混合物進行第一次CD31免疫磁珠分選以純化；

S3、對S2處理后的腦微血管內皮細胞進行第二次CD31免疫磁珠分選以純化，即得純化后的腦微血管內皮細胞。

通過采用上述方案，將采用CD31免疫磁珠結合腦微血管內皮細胞進行二次分選，使腦微血管內皮細胞與雜質細胞或組織相互分離，操作步驟相對簡單，不需要對CD31免疫磁珠進行洗脫工序，降低了純化過程中對腦微血管內皮細胞的機械損傷和活性損傷，分離效率高，可以獲得高純度、高活性和高產量的腦微血管內皮細胞。

作為優選方案，在所述S2中，對S1處理后的腦微血管內皮細胞混合物進行第一次CD31免疫磁珠分選，隨后貼壁培養；在所述S3中，收集貼壁培養后腦微血管內皮細胞進行第二次CD31免疫磁珠分選，隨后貼壁培養，即得純化后的腦微血管內皮細胞。

作為優選方案，在所述S3中，對所述純化后的腦微血管內皮細胞進行DiI-Ac-LDL和FITC-UEA-1雙吞噬實驗、血管生成實驗和免疫熒光染色實驗以鑒定腦微血管內皮細胞。

作為優選方案，在所述S2中，具體包括以下步驟：

S201、加入ECM培養基于S1粗提的腦微血管內皮細胞混合物中重懸細胞，加入CD31免疫磁珠，移入EP管，置于4℃搖床中結合；