[發(fā)明專利]一種腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞提取純化方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110876479.5
• 申請(qǐng)日: 2021-07-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113564100B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-05-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃志新;劉新通;盧海克
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣東省第二人民醫(yī)院（廣東省衛(wèi)生應(yīng)急醫(yī)院）
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利商標(biāo)代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫

1.一種腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞提取純化方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、粗提小鼠腦組織中的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞；

S2、對(duì)S1處理后的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞混合物進(jìn)行第一次CD31免疫磁珠分選以純化，隨后貼壁培養(yǎng)；

S3、對(duì)S2處理后的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行第二次CD31免疫磁珠分選以純化，隨后貼壁培養(yǎng)，即得純化后的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞；

在所述S2中，具體包括以下步驟：

S201、加入ECM培養(yǎng)基于S1粗提的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞混合物中重懸細(xì)胞，加入CD31免疫磁珠，所述CD31免疫磁珠的添加量為25μL磁珠/10⁸個(gè)細(xì)胞，移入EP管，置于4℃搖床中結(jié)合；

S202、吸棄上清，加入ECM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于預(yù)先使用Ⅰ型膠原包被過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37℃二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育；

S203、隔天使用F12培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞，以除去組織和細(xì)胞碎片，加入ECM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；

在所述S3中，具體包括以下步驟：

S301、將所述S2處理后的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)到細(xì)胞密度達(dá)80％，胰酶消化后用ECM培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞；

S302、對(duì)所述S301處理收集的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行第二次CD31磁珠分選，所述第二次CD31磁珠分選的步驟與S2中第一次CD31磁珠分選的步驟和參數(shù)控制相同，繼續(xù)培養(yǎng)后即得純化的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞；

所述ECM培養(yǎng)基具體包括以下成分：肝素：0.5v％；谷氨酰胺：1v％；100x青-鏈霉素：1v％；FBS：10v％；內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充物：0.03w/v％；F12培養(yǎng)基：余量。

2.如權(quán)利要求1所述的一種腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞提取純化方法，其特征在于，在所述S3中，對(duì)所述純化后的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行DiI-Ac-LDL和FITC-UEA-1雙吞噬實(shí)驗(yàn)、血管生成實(shí)驗(yàn)和免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)以鑒定腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞。

3.如權(quán)利要求1所述的一種腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞提取純化方法，其特征在于，在所述S1中，具體包括以下步驟：

S101、消毒小鼠頭部后斷頭取腦，置于裝有預(yù)冷的Hank’s液的10cm培養(yǎng)皿中，以Hank’s液沖洗腦組織，隨后將腦組織切成小塊；

S102、加入IMDM培養(yǎng)基于所述腦組織中，離心后棄去上清液，并向腦組織沉淀物中加入蛋白水解酶，放入37℃培養(yǎng)箱中孵育；

S103、孵育結(jié)束后，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中研磨，使腦組織懸液呈粉紅色勻漿；

S104、在所述腦組織懸液中加入22％BSA，混勻后離心，離心后吸出上層的髓鞘組織和中層的BSA，即得下層的微血管段和腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞沉淀；

S105、以ECM培養(yǎng)基重懸所述微血管段和腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞沉淀，再加入ECM離心和洗滌，得到粗提處理的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞混合物。

4.如權(quán)利要求3所述的一種腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞提取純化方法，其特征在于，在所述S103中，采用19號(hào)針頭對(duì)所述腦組織研磨5-7次，隨后用21號(hào)針頭進(jìn)一步研磨，在每一次研磨操作時(shí)將所述腦組織懸液完全吸入再完全擠出。

5.如權(quán)利要求3所述的一種腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞提取純化方法，其特征在于，所述蛋白水解酶為木瓜蛋白酶。