[發明專利]基于CRISPR/dcas9的宿主與病原微生物DNA快速分離方法

在審

• 申請號: 202110876431.4
• 申請日: 2021-07-29
• 公開（公告）號: CN113564227A
• 公開（公告）日: 2021-10-29
• 發明（設計）人: 江翱;陳晶晶;盧瑤;蘇杰;孫睿;王嫚;曹振;宋東亮
• 申請（專利權）人: 翌圣生物科技（上海）股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12N15/113
• 代理公司: 蘇州根號專利代理事務所(普通合伙) 32276
• 代理人: 朱華慶

本發明提供一種基于CRISPR/dcas9的宿主與病原微生物DNA快速分離方法，利用覆蓋宿主全基因組的sgRNA庫，與帶標簽的dCas9蛋白孵育組裝，獲得dCas9?sgRNA復合物，再與待測宿主樣本DNA孵育，利用親和磁珠或樹脂特異性捕獲帶對應標簽的dCas9?sgRNA?宿主DNA復合物，從而將宿主基因組DNA與病原微生物DNA分離。本發明方法使用范圍更廣、靈敏度更高、安全性更好、效率更高、偏好性更小、操作更簡單、耗時更短。本發明方法不需要復雜的提取分離操作，也不需要保留病理樣本中細胞的完整性，能夠適用于各類經醫學處理的病理樣本。既減少了病理樣本儲存和處理的難度和成本，也極大增強了病理樣本儲存和處理的安全性。

技術領域

本發明專利涉及一種基于CRISPR/dcas9的宿主與病原微生物DNA快速分離方法，屬于生物技術領域。

背景技術

病原微生物檢測是疾病診斷領域的重要項目，基于RT-qPCR或者分子標志物的傳統檢測方法只能檢測某一個或者某一類病原微生物，無法對于未知病原或未知病癥進行有效的診斷。隨著腸道微生物和病原微生物領域的興起，許多疾病或癥狀是多種微生物共同作用的結果。因此，高通量基因組學技術和高通量轉錄組學技術被用于系統鑒定病理學樣本中的微生物種類，為病原微生物致使疾病的診斷提供了強大的診斷工具，被稱為宏基因組新一代測序技術(metagenomics next generation sequencing,mNGS)。但是，病理樣本中通常含有大量的病人自身的細胞和核酸(高達90-99％)，這極大地占據了測序的數據，使得有效數據的占比只有不到10％。這不僅提高了測序的數據量和測序成本，也降低了病原微生物檢出的效率和準確性。因此，開發一種能夠有效靶向去除人類自身DNA或者RNA的技術，對于提高病理樣本中致病微生物的檢出效率，降低檢測成本，具有重要的意義。

目前市面上主要還是利用差異裂解法來去除宿主基因組，其主要原理是利用細菌通常具有細胞壁，因此可以承受較為劇烈的裂解條件，從而達到針對性裂解宿主細胞的目的。宿主細胞裂解后可以通過核酸酶消解去除宿主核酸，完整的細菌和真菌隨后被分離以及進一步核酸提取。但是，這種差異裂解法對宿主基因組的去除效率低，對微生物核酸的保留也不完整。而且反復的洗滌過程會導致大量的損失。這些導致回收的微生物損失嚴重，且具有嚴重的偏好性(越難被裂解和越容易回收的微生物保留越完整，如革蘭氏陽性菌)。這些導致利用差異裂解法進行mNGS檢測具有嚴重的偏好性和較大的微生物種類損失，阻礙了mNGS在致病微生物診斷領域的應用。很多病理學樣本在取樣和儲存過程中就會造成病原微生物細胞破裂(如高溫滅活處理和低溫冷藏等)，這些樣本無法使用差異裂解法來進行病原微生物核酸富集，影響了病原微生物的檢測精確性。此外，因為病理學樣本具有較強的傳染性和致病性，因此在分離過程中需要在指定要求的生物安全柜和高生物安全等級的實驗室中進行，這既增加了病原微生物分離的難度和成本，也給操作人員的安全帶來了隱患。而且，對于寄生于宿主細胞內部的病毒類病原微生物，無法使用差異裂解法進行病毒核酸的富集。因此，開發更加高效便捷且安全的宿主基因組去除技術，對于病原微生物檢測領域，具有重要的價值和作用。

CRISPR/Cas9基因編輯系統從被開發出來就一直受到基因診斷和治療領域的重點關注。相較于傳統的基因編輯技術，CRISPR技術具有編輯效率高、特異性高、操作簡單等優點。因此，CRISPR技術在生命科學和醫療領域收到了廣泛的應用和改進，包括CRISPR/dCas9系統、CRISPR/Cas12系統、CRISPR/Cas13系統等工具。CRISPR/dCas9系統將Cas9核酸酶進行了核酸內切酶活性位點(D10A和H840A)失活突變，但不改變Cas9蛋白結合靶DNA的高親和力和高特異性。因此，CRISPR/dCas9可以作為靶位點DNA捕獲的高效率高特異性工具。

發明內容

本發明的目的是提供一種基于CRISPR/dcas9的宿主與病原微生物DNA快速分離方法。

本發明采用的技術方案為：

一種基于CRISPR/dcas9的宿主與病原微生物DNA快速分離方法，其步驟包括：