[發明專利]基于CRISPR/dcas9的宿主與病原微生物DNA快速分離方法在審
| 申請號： | 202110876431.4 | 申請日： | 2021-07-29 |
| 公開（公告）號： | CN113564227A | 公開（公告）日： | 2021-10-29 |
| 發明（設計）人： | 江翱;陳晶晶;盧瑤;蘇杰;孫睿;王嫚;曹振;宋東亮 | 申請（專利權）人： | 翌圣生物科技（上海）股份有限公司 |
| 主分類號： | C12Q1/6806 | 分類號： | C12Q1/6806;C12N15/113 |
| 代理公司： | 蘇州根號專利代理事務所(普通合伙) 32276 | 代理人： | 朱華慶 |
| 地址： | 200120 上海市浦*** | 國省代碼： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 基于 crispr dcas9 宿主 病原微生物 dna 快速 分離 方法 | ||
1.一種基于CRISPR/dcas9的宿主與病原微生物DNA快速分離方法，其步驟包括：
(1)設計覆蓋宿主全基因組的sgRNA探針，所有的sgRNA探針組成sgRNA庫；
(2)根據步驟(1)中設計的sgRNA庫，合成sgRNA引物，并混合成sgRNA引物庫；
(3)使用步驟(2)獲得的宿主全基因組sgRNA引物庫，引物和引物自身相互擴增，從而擴增出全基因組sgRNA的雙鏈DNA模板；
(4)根據步驟(3)中的雙鏈DNA模板，體外轉錄sgRNA庫，DNase I消解，回收sgRNA庫；
(5)將步驟(4)中獲得的sgRNA庫，與帶標簽的dCas9蛋白孵育組裝，獲得dCas9-sgRNA復合物；
(6)將步驟(5)組裝的dCas9-sgRNA復合物與待測宿主樣本DNA孵育；
(7)用親和磁珠或樹脂特異性捕獲帶對應標簽的dCas9-sgRNA-宿主DNA復合物；
(8)步驟(7)中捕獲后上清的DNA，即為富集的病原微生物DNA；
(9)將步驟(7)中的親和磁珠或樹脂洗脫，即為宿主基因組DNA。
2.根據權利要求1所述的宿主與病原微生物DNA快速分離方法，其特征在于：步驟(1)中sgRNA庫相對均勻地覆蓋宿主全基因組，相鄰兩個sgRNA探針的靶位點之間的距離不高于2Mbp。
3.根據權利要求2所述的宿主與病原微生物DNA快速分離方法，其特征在于：sgRNA庫中每條sgRNA探針的SAE值中的特異性分數和效率分數不低于0.4，sgRNA探針在微生物基因組DNA上沒有靶位點或上靶位點的特異性分數不高于0.2。
4.根據權利要求3所述的宿主與病原微生物DNA快速分離方法，其特征在于：sgRNA引物庫中的每條引物的投入摩爾量基本相同。
5.根據權利要求1所述的宿主與病原微生物DNA快速分離方法，其特征在于：sgRNA引物庫中的每條引物為在sgRNA探針的5’端加上T7啟動子序列，3’端加上tracrRNA序列。
6.根據權利要求1所述的宿主與病原微生物DNA快速分離方法，其特征在于：步驟(4)中體外轉錄使用T7 RNA聚合酶。
7.根據權利要求1所述的宿主與病原微生物DNA快速分離方法，其特征在于：步驟(5)dCas9蛋白是經核酸內切酶活性位點失活突變的Cas9蛋白。
8.根據權利要求7所述的宿主與病原微生物DNA快速分離方法，其特征在于：步驟(5)中帶標簽的dCas9蛋白是biotin-dCas9、Spy-dCas9或Flag-dCas9。
9.根據權利要求1所述的宿主與病原微生物DNA快速分離方法，其特征在于：步驟(7)中親和磁珠為鏈霉親和素磁珠、SNAP-tag磁珠或Anti-flag磁珠。
10.根據權利要求1所述的宿主與病原微生物DNA快速分離方法，其特征在于：步驟(7)中親和樹脂為鏈霉親和素瓊脂糖樹脂或Anti-flag瓊脂糖樹脂。
11.根據權利要求1所述的宿主與病原微生物DNA快速分離方法，其特征在于：步驟(5)中dCas9與sgRNA的總摩爾比為1：4-1：96。
12.根據權利要求1所述的宿主與病原微生物DNA快速分離方法，其特征在于：sgRNA庫總量與DNA總量的投入質量比為30：1-300：1。
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