[發明專利]一種產D-塔格糖的基因工程菌及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 202110873401.8
• 申請日: 2021-07-30
• 公開（公告）號: CN113528416B
• 公開（公告）日: 2022-12-16
• 發明（設計）人: 齊向輝;張國艷;員君華;李小蘭;張宇飛;王江飛
• 申請（專利權）人: 江蘇大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/61;C12N15/56;C12N15/70;C12P19/02;C12R1/19
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明提供了一種產D?塔格糖的基因工程菌及其構建方法和應用，屬于生物工程技術領域；本發明中，利用基因工程的手段，在E.coli BL21的基礎上構建了聯合表達L?阿拉伯糖異構酶(L?AI)和β?半乳糖苷酶(β?gal)的基因工程菌，并將該基因工程菌用于轉化乳清粉制備D?塔格糖，D?塔格糖的產量達到70～120g/L。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種產D-塔格糖的基因工程菌及其構建方法和應用。

背景技術

D-塔格糖是一種天然己酮糖，分子式為C₆H₁₀O₆，其是一種低熱量甜味益生元，具有改善腸道菌群、治療Ⅱ型糖尿病、降低膽固醇、抗齲齒、治療貧血等功效。2001年，美國FDA批準其為普遍公認安全食品(GRAS)，因此可代替蔗糖廣泛應用于果汁、飲料、口香糖等食品領域，同時還被廣泛應用于醫藥行業。

目前，D-塔格糖的生產主要有化學法和生物法兩種，其中化學法存在著能耗高、副產物多、純化煩瑣和污染大等缺點，不利于工業化生產。與化學法相比，生物法合成D-塔格糖具有環境友好、特異性高、副產物少、條件溫和等優勢，是未來D-塔格糖工業化生產的必然趨勢。生物法通常以D-半乳糖為底物，利用L-阿拉伯糖異構酶(L-arabinose isomerase，L-AI)將其異構化為D-塔格糖，但由于D-半乳糖作為底物不夠廉價且轉化率不足等局限性。

近年來，研究者們逐漸將目光轉向以更加廉價易得的工農業副產物乳清粉或商業化乳糖為底物制備D-塔格糖，即利用β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,β-gal)水解乳糖生成D-葡萄糖和D-半乳糖后，生成的D-半乳糖再經L-AI制備D-塔格糖。目前關于乳清粉或乳糖制備D-塔格糖已有少量研究，但目前的研究報道中存在著利用昂貴的商業化β-半乳糖苷酶、關鍵酶來源不安全或性質不適宜、全細胞法存在細胞需求量大、異構化熱力學平衡引起的D-塔格糖產量不高等問題。因此，基于過表達來源安全的β-gal和L-AI構建的基因工程菌，探索如何有效降低生產成本并提高D-塔格糖的產量是實現由廉價底物乳清粉生產D-塔格糖的工業化的必經之路。

發明內容

針對現有技術中存在不足，本發明提供了一種產D-塔格糖的基因工程菌及其構建方法和應用。本發明中，利用基因工程的手段，在E.coli BL21的基礎上構建了聯合表達L-阿拉伯糖異構酶(L-AI)和β-半乳糖苷酶(β-gal)的基因工程菌，并將該基因工程菌用于轉化乳清粉制備D-塔格糖。

本發明首先提供了一種用于生產D-塔格糖的基因工程菌，記為E.coli BL21/β-gal-L-AI，其通過在E.coli BL21上構建表達L-阿拉伯糖異構酶(L-AI)和β-半乳糖苷酶(β-gal)而得到。

本發明還提供了上述基因工程菌的構建方法，具體包括如下步驟：

(1)L-阿拉伯糖異構酶(L-AI)工程菌的構建：

PCR擴增來源于植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum CY.6)中的L-阿拉伯糖異構酶(L-AI)基因，使用無縫克隆技術克隆至表達載體pANY1中，得到重組質粒pANY1-araA，經過將重組質粒轉化至E.coli DH5α、篩選陽性克隆、測序得到E.coli DH5α/L-AI，然后將E.coli DH5α/L-AI培養、抽提重組質粒，并將重組質粒轉化至E.coli BL21感受態中，得到L-阿拉伯糖異構酶(L-AI)工程菌，記為E.coli BL21/L-AI；

(2)β-半乳糖苷酶(β-gal)工程菌的構建：