[發(fā)明專利]一種產(chǎn)D-塔格糖的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110873401.8
• 申請日: 2021-07-30
• 公開（公告）號: CN113528416B
• 公開（公告）日: 2022-12-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 齊向輝;張國艷;員君華;李小蘭;張宇飛;王江飛
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇大學(xué)
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/61;C12N15/56;C12N15/70;C12P19/02;C12R1/19
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1. 一種用于生產(chǎn)D-塔格糖的基因工程菌，記為E.coli BL21/β-gal-L-AI，其特征在于，其通過在E.coli BL21上構(gòu)建表達(dá)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶和β-半乳糖苷酶而得到；所述用于生產(chǎn)D-塔格糖的基因工程菌的構(gòu)建方法，包括：

(1)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶工程菌的構(gòu)建：

PCR擴(kuò)增來源于植物乳桿菌中的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因，使用無縫克隆技術(shù)克隆至表達(dá)載體pANY1中，得到重組質(zhì)粒pANY1-araA，經(jīng)過將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α、篩選陽性克隆、測序得到E.coli DH5α/L-AI，然后將E.coli DH5α/L-AI培養(yǎng)、抽提重組質(zhì)粒，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21感受態(tài)中，得到L-阿拉伯糖異構(gòu)酶工程菌，記為E.coli BL21/L-AI；

(2)β-半乳糖苷酶工程菌的構(gòu)建：

PCR擴(kuò)增來源于羅伊氏乳桿菌中的β-半乳糖苷酶基因，使用無縫克隆技術(shù)克隆至表達(dá)載體pFXZ02中，得到重組質(zhì)粒pFXZ02-lacLM，經(jīng)過將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α、篩選陽性克隆以及測序得到E.coli DH5α/β-gal，然后將E.coli DH5α/β-gal培養(yǎng)、抽提重組質(zhì)粒，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21感受態(tài)中，得到β-半乳糖苷酶工程菌，記為E.coli BL21/β-gal；

(3)基因工程菌E.coli BL21/β-gal-L-AI的構(gòu)建：

利用CaCl ₂ 法制備E.coli BL21/β-gal感受態(tài)細(xì)胞，并將重組質(zhì)粒pANY1-araA熱激法轉(zhuǎn)化入E.coli BL21/β-gal感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含Kan-Cl-LB雙抗平板上，經(jīng)陽性克隆子的篩選與驗(yàn)證，獲得基因工程菌E.coli BL21/β-gal-L-AI；

其中，步驟(1)和(2)不分先后順序。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于生產(chǎn)D-塔格糖的基因工程菌，其特征在于，步驟(1)中PCR擴(kuò)增的條件為：預(yù)變性：98℃、3min，變性：98℃、10s，退火：58℃、30s，延伸：72℃、45s，終延伸：72℃、10min，35個循環(huán)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于生產(chǎn)D-塔格糖的基因工程菌，其特征在于，步驟(2)中，PCR擴(kuò)增的條件為：預(yù)變性：98℃、3min，變性：98℃、10s，退火：58℃、30s，延伸：72℃、85s，終延伸：72℃、10min，35個循環(huán)。

4.權(quán)利要求1所述的用于生產(chǎn)D-塔格糖的基因工程菌在制備D-塔格糖中的應(yīng)用。

5.一種分批補(bǔ)料乳清粉產(chǎn)D-塔格糖的方法，其特征在于，具體包括：

(1) 制備同時含過表達(dá)β-gal與L-AI的重組靜息細(xì)胞：

將權(quán)利要求1所述基因重組菌E.coli BL21/β-gal-L-AI接種于Kan-Cl-LB雙抗培養(yǎng)基中，向其中加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，獲得表達(dá)成功的E.coli BL21/β-gal-L-AI，將表達(dá)成功的E.coli BL21/β-gal-L-AI低溫離心，然后用含Triton-x-100的磷酸鈉緩沖液室溫處理離心后的細(xì)胞，接著再次離心，收集細(xì)胞，洗滌，得到同時含過表達(dá)β-gal與L-AI的重組靜息細(xì)胞；

(2) 分批補(bǔ)料乳清粉制備D-塔格糖：

將步驟(1)中制得的重組靜息細(xì)胞加入乳清粉溶液混合反應(yīng)，并采取分批補(bǔ)料乳清粉的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)化以制備D-塔格糖；

所述分批補(bǔ)料乳清粉的方式為在反應(yīng)5h或12h后向反應(yīng)液中補(bǔ)充終濃度為50-60g/L乳糖的乳清粉，共補(bǔ)料4～6次，補(bǔ)料結(jié)束后繼續(xù)反應(yīng)至D-塔格糖濃度不增加為止。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的分批補(bǔ)料乳清粉產(chǎn)D-塔格糖的方法，其特征在于，步驟(1)中，所述IPTG的終濃度為1mM；所述含Triton-x-100的磷酸鈉緩沖液中Triton-x-100的體積分?jǐn)?shù)為2％。