[發明專利]一種鑒定腫瘤細胞的染色體外環狀DNA組成基因的方法

有效

• 申請號: 202110863650.9
• 申請日: 2021-07-29
• 公開（公告）號: CN113724788B
• 公開（公告）日: 2023-09-12
• 發明（設計）人: 張瑩;董科顯;賈學淵;王冬;于景翠;白靜;傅松濱
• 申請（專利權）人: 哈爾濱醫科大學
• 主分類號: G16B30/00
• 分類號: G16B30/00;G16B40/00;G16B20/50;G16B20/20
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨

本發明公開一種鑒定腫瘤細胞的染色體外環狀DNA組成基因的方法，通過在二代測序中加入umi以修正PCR導致的誤差，然后針對腫瘤樣本的二代測序數據設計了過濾算法以及提出新的更適合分析染色體外DNA的質控標準，最后通過聯合三代測序校正接頭序列，以確保預測的準確性。

技術領域

本發明涉及生物信息技術領域，具體而言，涉及一種鑒定腫瘤細胞的染色體外環狀DNA組成基因的方法。

背景技術

染色體外環狀DNA(extrachromosomal?circular?DNAs，eccDNAs)為產生于染色體上的序列，在起源上有較高的異質性，可以影響細胞的生命活動，促進腫瘤細胞演進和適應性進化，是腫瘤的重要基因組特征。

染色體外環狀DNA，最早在1965年，由HOTTA?Y通過對腫瘤細胞核型分析發現的，但是因為當時分子技術水平的局限，未能得到廣泛的關注，后來由于FISH(Fluorescence?insitu?hybridization，熒光原位雜交技術)技術的興起，人們進一步了解了染色體外環狀DNA的分子結構。但是FISH技術存在如下缺點：1)FISH實驗手段非常繁瑣，造價高昂；2)其分辨率很低，只能檢測到1M左右的區域；3)對實驗樣本的要求很高，如必須得到中期分裂的細胞，這對于臨床上組織樣本的檢測是無法實現的。因此，由于分辨率的限制，目前的技術只能獲得較大片段的染色體外環狀DNA上的基因信息，急需更高分辨率，準確性更高的手段來探索染色體外環狀DNA上基因，這對于腫瘤的診斷及治療有著重要意義。

在2019年，Deshpande?V發明了一款軟件，AmpliconArchitect，其利用二代測序數據對染色體外DNA進行預測。但是該軟件在使用時需要提供指定的bed(靶向測序中一個能夠指示目標基因位置的文件類型)區域，而該軟件目前沒有任何可以預測bed區域的工具，另外，因為腫瘤細胞的基因擴增是異常的，而該軟件并未就腫瘤細胞的拷貝數進行有效校正。

因此，現有技術對于染色體外環狀DNA的結構、組成仍然缺乏較為廣泛而深入的研究，需要一種能夠對染色體的染色體外環狀結構進行預測及驗證的方法。

發明內容

為了解決上述問題，本發明提供一種鑒定腫瘤細胞的染色體外環狀DNA組成基因的方法，通過在測序建庫過程中，加入指定的umi(Unique?Molecular?Identifiers序列)，以修正PCR(Polymerase?Chain?Reaction，聚合酶鏈反應)導致的誤差，并且針對腫瘤樣本的二代測序數據設計了過濾算法以及提出新的更適合分析染色體外DNA的質控標準。

本發明的另一目的在于，提供了一種能夠準確預測bed區域的算法，針對腫瘤細胞內異常擴增的基因組片段以及發生染色體結構變異片段進行定位，為后續利用圖論進行環狀染色體分析提供基礎。

為達到上述目的，本發明提供了一種鑒定腫瘤細胞的染色體外環狀DNA組成基因的方法，其包括以下步驟：

步驟1：通過illumina平臺對待分析樣本進行全基因組二代測序，得到過濾后滿足條件的fastq格式文件的二代測序結果，并進行質控；

步驟2：通過CNVkit對步驟1中二代測序結果進行拷貝數變異統計，并對得到的cnr文件進行均一化處理；

步驟3：通過AmpliconArchitect軟件進行染色體外DNA的結構預測，并根據hg19參考基因組得到染色體外環狀DNA在基因坐標軸的范圍以及對應范圍上所包含基因；

步驟4：通過Delly軟件進行SV分析，并對得到的vcf格式的結果文件進一步進行篩選；

步驟5：將步驟4得到的結果與步驟2得到的結果結合后，與步驟3的結果取交集，得到一區域交界處的接頭序列，然后將環狀結構進行組裝得到一樣本；