[發(fā)明專利]一種鑒定腫瘤細(xì)胞的染色體外環(huán)狀DNA組成基因的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110863650.9
• 申請日: 2021-07-29
• 公開（公告）號: CN113724788B
• 公開（公告）日: 2023-09-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張瑩;董科顯;賈學(xué)淵;王冬;于景翠;白靜;傅松濱
• 申請（專利權(quán)）人: 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號: G16B30/00
• 分類號: G16B30/00;G16B40/00;G16B20/50;G16B20/20
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨

1.一種鑒定腫瘤細(xì)胞的染色體外環(huán)狀DNA組成基因的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1：通過illumina平臺對待分析樣本進(jìn)行全基因組二代測序，得到過濾后滿足條件的fastq格式文件的二代測序結(jié)果，并進(jìn)行質(zhì)控；

步驟2：通過CNVkit對步驟1中二代測序結(jié)果進(jìn)行拷貝數(shù)變異統(tǒng)計，并對得到的cnr文件進(jìn)行均一化處理；

步驟3：通過AmpliconArchitect軟件進(jìn)行染色體外DNA的結(jié)構(gòu)預(yù)測，并根據(jù)hg19參考基因組得到染色體外環(huán)狀DNA在基因坐標(biāo)軸的范圍以及對應(yīng)范圍上所包含基因；

步驟4：通過Delly軟件進(jìn)行SV分析，并對得到的vcf格式的結(jié)果文件進(jìn)一步進(jìn)行篩選；

步驟5：將步驟4得到的結(jié)果與步驟2得到的結(jié)果結(jié)合后，與步驟3的結(jié)果取交集，得到一區(qū)域交界處的接頭序列，然后將環(huán)狀結(jié)構(gòu)進(jìn)行組裝得到一樣本；

步驟6：對組裝后得到的樣本進(jìn)行Pacbio長序列測序，并與hg19參考基因組比對后得到比對后的第二bam文件，再進(jìn)行篩選校正；

步驟7：將步驟5中組裝后的樣本序列重命名并加入到hg19參考基因組，再次進(jìn)行比對以確認(rèn)是否為染色體外環(huán)狀DNA。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1具體為：

步驟11：采用barcode+NGS的方式進(jìn)行全基因組二代測序，具體為通過illumina平臺對待分析樣本進(jìn)行全基因組二代測序，再通過腳本程序在得到的fastq文件中提取umi序列，對提取到的所有umi序列進(jìn)行聚類和信息統(tǒng)計分析，將支持?jǐn)?shù)的相同的umi序列進(jìn)行合并；

步驟12：根據(jù)統(tǒng)計分析結(jié)果將測序得到的序列中相同的barcode的序列合并，將合并后的集合作為一致性序列的集合，并在集合內(nèi)修正因PCR和測序誤差對reads本身的影響；

步驟13：通過BWA軟件對提取后的fastq文件與hg19參考基因組進(jìn)行比對，得到比對后第一bam格式文件。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1中的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)具體為去除N的比例大于10％的reads，其中N為未成功識別到的堿基。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2中均一化處理的算法具體為：

步驟21：將第一bam文件通過pysam選取10kb為一個bin，計算所有bin的平均覆蓋度，排除覆蓋度為0或者覆蓋度大于5倍整體平均覆蓋度方差的區(qū)域；

步驟22：重新計算平均覆蓋度、方差及標(biāo)準(zhǔn)差,并通過下式計算得到任一窗口區(qū)域的高斯核函數(shù)參數(shù)，

式中，j代表迭代次數(shù)，r_i，r_j代表窗口區(qū)域中的任意兩個bin即bin?i和bin?j，H_b為bin的位序，H_r為bin的帶寬，norm表示恒定系數(shù)；

步驟23：當(dāng)ΔF為大于0時，認(rèn)定對應(yīng)區(qū)域為一個邊界；當(dāng)ΔF小于0時，將對應(yīng)區(qū)域合并到下一個區(qū)域，繼續(xù)根據(jù)上式進(jìn)行迭代，以得到篩選區(qū)域，其中，ΔF為當(dāng)前計算的高斯核函數(shù)參數(shù)的值與上一次計算的高斯核函數(shù)參數(shù)的值的差值；

步驟24：在cnr文件中對篩選出來的區(qū)域進(jìn)行K-mean聚類得到cns文件，并選取Copynumber5,Length100的區(qū)域作為bed文件候選區(qū)域，其中，Copynumber為拷貝數(shù)，Length為長度。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3具體為：

步驟31：通過AmpliconArchitect軟件對步驟13得到的第一bam文件進(jìn)行染色體外DNA的結(jié)構(gòu)預(yù)測；

步驟32：當(dāng)測序深度5X時通過向下采樣將深度調(diào)整為5X，并使用hg19參考基因組得到染色體外環(huán)狀DNA在基因坐標(biāo)軸的范圍，其中X為倍數(shù)；

步驟33：得到基因坐標(biāo)軸的范圍上所包含的基因。