[發明專利]一種基于納米孔測序儀的微生物快速鑒定方法

在審

• 申請號: 202110863381.6
• 申請日: 2021-07-29
• 公開（公告）號: CN113667729A
• 公開（公告）日: 2021-11-19
• 發明（設計）人: 谷紅倉;湯文奕;許佩松;王云飛;車仙榮
• 申請（專利權）人: 杭州圣庭醫療科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/689;C12Q1/6895;C12Q1/04
• 代理公司: 杭州華鼎知識產權代理事務所(普通合伙) 33217
• 代理人: 魏亮

本發明公開了一種基于納米孔測序儀的微生物快速鑒定方法，屬于分子生物學領域，鑒定方法包括如下步驟：步驟一，設計覆蓋細菌的16S與真菌的ITS基因待測區域的自主設計的引物，序列為SEQ01?04；步驟二，將第二輪擴增時與Barcode引物退火時相結合的序列混合形成引物池；步驟三，接收樣本，提取DNA；步驟四，第一輪擴增，純化；第二輪擴增，純化；步驟五，構建最終文庫；步驟六，將最終文庫進行納米孔測序，分析確認樣本感染的病原微生物；通過本發明設計的覆蓋細菌的16S與真菌的ITS基因待測區域的引物組合再結合新型納米孔測序法，能夠實現感染性疾病病原微生物的快速臨床診斷，具備高通量，快速檢測的優勢。

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，特別是一種基于納米孔測序儀的微生物快速鑒定方法。

背景技術

臨床上有大量的病例需要進行感染病原菌的檢測，其中每年至少有50萬例為重癥感染病人。目前，臨床檢測病原微生物主要通過傳統的細菌培養鑒定方法，其過程包括微生物的培養及分離、物種鑒定及藥敏試驗。傳統的病原檢測方法存在病原周期長，檢測覆蓋度低，部分病原無法檢測或需要很長時間才能檢出，以及無法得到病原的豐度信息等局限性。近年來，高通量基因測序技術的發展，使得我們能夠直接從患者的腦脊液、胸水、腹水、肺泡灌洗液等樣本中提取核酸，短時間內一次性檢測樣本中幾乎所有潛在的病原體。

但是市場上的檢測方法還是不能檢測出較低豐度的致病微生物，且為了檢測細菌種類的覆蓋率高，需要大量時間，市場需要一種能夠降低測序時間的方法，本發明通過找到覆蓋細菌的16S與真菌的ITS基因待測區域的自主設計的引物和新型納米孔測序法（nanopore sequencing）技術解決以上問題。

發明內容

為解決現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種基于納米孔測序儀的微生物快速鑒定方法，本發明通過設計覆蓋細菌的16S與真菌的ITS基因待測區域的引物組合并結合新型納米孔測序法，實現快速進行微生物的基因組比對和種屬鑒定，便于實現感染性疾病病原微生物的快速臨床診斷，使該檢測方法具備高通量，快速檢測的優勢。

為了達到上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種基于納米孔測序儀的微生物快速鑒定方法，包括如下步驟：

步驟一，設計覆蓋細菌的16S與真菌的ITS基因待測區域的自主設計的引物，序列為SEQ01-04；

步驟二，在SEQ01-04的正向引物的5’端加上AGGTCTTCACGATACGTCGAG堿基序列，反向引物的5’端加上GTCCAATCAGTTGCAGCTTCAG堿基序列，得到第二輪擴增時與Barcode引物退火時相結合的序列，將第二輪擴增時與Barcode引物退火時相結合的序列混合形成引物池；

步驟三，接收樣本，提取DNA；

步驟四，采用引物池進行第一輪擴增，純化；再選用Barcode進行第二輪擴增，純化；

步驟五，構建最終文庫；

步驟六，將最終文庫進行納米孔測序，分析確認樣本感染的病原微生物。

前述的一種基于納米孔測序儀的微生物快速鑒定方法，步驟二中所述第二輪擴增時與Barcode引物退火時相結合的序列按照濃度比例1：1：1：1混合形成引物池。

前述的一種基于納米孔測序儀的微生物快速鑒定方法，樣本包括：肺泡灌洗液、痰液、胸腹水、腦脊液或EDTA抗凝血。

前述的一種基于納米孔測序儀的微生物快速鑒定方法，步驟四中第一輪擴增的反應體系包括：2*PCR mix 12.5μL，引物池3μL，模板DNA 9.5μL；反應程序為：105℃ 熱蓋；95℃ 3min；95℃ 30sec，62℃ 1min，72℃ 1min，25個循環；72℃ 3min ；4℃ Hold；

純化采用磁珠純化。