[發明專利]一種基于納米孔測序儀的微生物快速鑒定方法

在審

• 申請號: 202110863381.6
• 申請日: 2021-07-29
• 公開（公告）號: CN113667729A
• 公開（公告）日: 2021-11-19
• 發明（設計）人: 谷紅倉;湯文奕;許佩松;王云飛;車仙榮
• 申請（專利權）人: 杭州圣庭醫療科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/689;C12Q1/6895;C12Q1/04
• 代理公司: 杭州華鼎知識產權代理事務所(普通合伙) 33217
• 代理人: 魏亮

1.一種基于納米孔測序儀的微生物快速鑒定方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一，設計覆蓋細菌的16S與真菌的ITS基因待測區域的自主設計的引物，序列為SEQ01-04；

步驟二，在SEQ01-04的正向引物的5’端加上AGGTCTTCACGATACGTCGAG堿基序列，反向引物的5’端加上GTCCAATCAGTTGCAGCTTCAG堿基序列，得到第二輪擴增時與Barcode引物退火時相結合的序列，將第二輪擴增時與Barcode引物退火時相結合的序列混合形成引物池；

步驟三，接收樣本，提取DNA；

步驟四，采用引物池進行第一輪擴增，純化；再選用Barcode進行第二輪擴增，純化；

步驟五，構建最終文庫；

步驟六，將最終文庫進行納米孔測序，分析確認樣本感染的病原微生物。

2.根據權利要求1所述的一種基于納米孔測序儀的微生物快速鑒定方法，其特征在于，步驟二中所述第二輪擴增時與Barcode引物退火時相結合的序列按照濃度比例1：1：1：1混合形成引物池。

3.根據權利要求1所述的一種基于納米孔測序儀的微生物快速鑒定方法，其特征在于，所述樣本包括：肺泡灌洗液、痰液、胸腹水、腦脊液或EDTA抗凝血。

4.根據權利要求1所述的一種基于納米孔測序儀的微生物快速鑒定方法，其特征在于，所述步驟四中第一輪擴增的反應體系包括：2*PCR mix 12.5μL，引物池3μL，模板DNA 9.5μL；反應程序為：105℃ 熱蓋；95℃ 3min；95℃ 30sec，62℃ 1min，72℃ 1min，25個循環；72℃ 3min ；4℃ Hold；

純化采用磁珠純化。

5.根據權利要求1所述的一種基于納米孔測序儀的微生物快速鑒定方法，其特征在于，所述步驟四中第二輪擴增的反應體系包括：2*PCRmix 12.5μL，Barcode引物3μL，第一輪擴增純化產物10.5μL；反應程序為：105℃ 熱蓋；95℃ 3min；95℃ 30sec，64℃ 30 sec，72℃1min，12個循環；72℃ 3min ；4℃ Hold；

純化采用磁珠純化。

6.根據權利要求1所述的一種基于納米孔測序儀的微生物快速鑒定方法，其特征在于，步驟五中構建最終文庫的具體方法是：

（1）文庫pooling，得到文庫Mix DNA；

（2）末端修復：

末端修復反應體系為：End prep mix4 15μL，文庫Mix DNA XμL，ddH₂O 50-XμL；PCR程序為：105℃ 熱蓋，25℃ 15min，65℃ 15min，4℃ Hold；

（3）磁珠純化；

（4）接頭連接：

接頭連接反應體系為：上一步的DNA樣本 25μL，連接緩沖液10μL，Rapid DNA Ligase 5μL，Adapter Mix 1μL，ddH2O 9μL；PCR程序為：105℃ 熱蓋；20℃ 15min；4℃ Hold；

（5）磁珠純化；

（6）產物質檢；

（7）最終文庫配置體系為：Sequencing Buffer 18.8μL，Loading Beads 12.8μL，library XμL，ddH₂O 15.4-XμL。

7.根據權利要求1所述的一種基于納米孔測序儀的微生物快速鑒定方法，其特征在于，步驟六中納米孔測序使用Nanopore公司的MinION測序儀，測序試劑盒：SQK-LSK109，測序芯片：R9。

8.根據權利要求1所述的一種基于納米孔測序儀的微生物快速鑒定方法，其特征在于，步驟六中將最終文庫進行納米孔測序，分析確認樣本感染的病原微生物的具體步驟是：

a）芯片上機前質檢；

b）誘發：

誘發劑配置體系為：Flush Buffer 500μL，Flush Tether 15μL，ddH2O 200μL；

c）加樣；

d）測序；

e）下機數據分析：

下機數據與數據庫中的序列進行比對，分析每個樣本中各種菌株的豐度，確認樣本感染的病原微生物。