[發明專利]一株不依賴抗生素并能高效生產γ-氨基丁酸的谷氨酸棒桿菌的構建

有效

• 申請號: 202110861544.7
• 申請日: 2021-07-29
• 公開（公告）號: CN113583930B
• 公開（公告）日: 2023-08-08
• 發明（設計）人: 王小元;姚城鎮;胡曉清
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P13/00;C12R1/15
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 趙巧娜

1.一種重組谷氨酸棒桿菌，其特征在于，所述谷氨酸棒桿菌為谷氨酸棒桿菌ATCC13032，表達了來源于Lactobacillusbrevis的谷氨酸脫羧酶基因gadB2、來源于E.?coliW3110?谷氨酸脫氫酶基因gdhA和來源于E.?coli?W3110的檸檬酸合酶基因gltA，敲除了基因gabP、lldD、aldB2、eutD、poxB、ldh、pknG和基因簇gabTD，并且強化表達了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc和谷氨酰胺合成酶glnA2；所述基因gdhA、gadB2、gltA、glnA2插入谷氨酸棒桿菌ATCC?13032基因組中，所述基因gdhA的拷貝數為2，gadB2的拷貝數為3，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc的啟動子替換為啟動子P_tac或啟動子P_tacM；利用P_tac啟動子啟動所述基因glnA2表達，所述基因gltA插入ppc下游，利用啟動子P_tac或啟動子P_tacM表達gltA；

所述基因gabP、lldD、aldB2、eutD、poxB、ldh、pknG、gabTD、ppc、glnA2的核苷酸序列分別如GenBank：NC_003450.2的第504325~505572位、第3119621~3120883位、第2980179~2981699位、第2936506~2937891位、第2776766~2778505位、第3112447~3113391位、第2932365~2934833位、第501577~504286位、第1677384~1680143位和第2362816~2364156位所示；基因gadB2的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；所述啟動子P_tac的核苷酸序列如SEQ?IDNO.4所示；啟動子P_?tacM的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.6所示；

所述基因gdhA和gltA的核苷酸序列分別如GenBank：AP009048.1的第1844085~1845428位和第753607-754890位所示。

2.一種發酵生產γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，利用權利要求1所述重組谷氨酸棒桿菌為發酵菌株，發酵生產γ-氨基丁酸。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，培養所述重組谷氨酸棒桿菌并獲得OD_562nm為40?±?3的種子液，將種子液按體積比5~10%加入反應體系中，在28~37℃，150~200?rpm發酵培養不少于48小時。