[發明專利]一株不依賴抗生素并能高效生產γ-氨基丁酸的谷氨酸棒桿菌的構建

有效

• 申請號: 202110861544.7
• 申請日: 2021-07-29
• 公開（公告）號: CN113583930B
• 公開（公告）日: 2023-08-08
• 發明（設計）人: 王小元;姚城鎮;胡曉清
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P13/00;C12R1/15
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 趙巧娜

本發明公開了一株不依賴抗生素并能高效生產γ?氨基丁酸的谷氨酸棒桿菌的構建，屬于基因工程和微生物發酵技術領域。以谷氨酸棒桿菌ATCC?13032為出發菌株，將來源于Lactobacillusbrevis的谷氨酸脫羧酶基因整合入谷氨酸棒桿菌基因組中，構建γ?氨基丁酸(GABA)的生產菌株，該菌株以葡萄糖為碳源，利用直接發酵法即可得到GABA。本發明所用的基因表達調控均位于基因組中，不依賴質粒表達系統，因此不需要向培養基中額外添加抗生素。同時在本發明中，強化了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和檸檬酸合酶的共表達。最終通過分批補料發酵的方法得到GABA的產量為58.3g/L。

技術領域

本發明涉及一株不依賴抗生素并能高效生產γ-氨基丁酸的谷氨酸棒桿菌的構建，屬于基因工程和微生物發酵技術領域。

背景技術

γ-氨基丁酸(GABA)是一種重要的天然非蛋白質氨基酸，分子式C₄H₉NO₂，分子量103.1，廣泛存在于動物、植物及微生物中。

在動物體內，GABA是一種重要的抑制性神經遞質，對神經元的興奮程度有著重要的影響；在植物體內，與植物的抗逆性及抗真菌感染有重要關系；在某些微生物如大腸桿菌細胞內，GABA支鏈途徑是微生物重要的耐酸機制之一。

歐洲食品安全局(EFSA)、美國食品藥品監督管理局(FDA)和中國衛生部等均已批準GABA的商品化使用。目前GABA被廣泛應用于功能性食品添加劑、保健品、飼料添加劑、藥物及臨床研究中。

GABA的生產方法主要有化學合成法、酶或全細胞轉化法及微生物發酵法。化學合成法生產的GABA一般被禁止使用于食品及飲料添加劑中，酶或全細胞轉化法主要利用大腸桿菌或乳酸菌過表達谷氨酸脫羧酶，然后以谷氨酸或谷氨酸鈉為底物轉化所得，部分情況下需要額外添加磷酸吡哆醛(PLP)作為輔酶以調高產量，此方法GABA產量高，但是生產成本也相應較高。

微生物直接發酵法可以利用食品原料如淀粉、葡萄糖、玉米漿、木糖等作為原料，廉價易得、生產成本低，且產品可被應用于所有的GABA應用領域。目前，微生物直接發酵糖生產GABA的方法僅被報道在基因工程技術改造的大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌中，乳酸菌利用廉價碳源直接發酵生產方法尚未有報道，大腸桿菌發酵法的最高報道只有6.16g/L。谷氨酸棒桿菌是一種食品源安全菌株，且具有較強的前體谷氨酸合成能力，是一株潛在且理想的GABA生產菌株。目前基因工程改造谷氨酸棒桿菌生產GABA主要的方法是利用表達質粒在菌株內過表達谷氨酸脫羧酶，利用一株工業高產谷氨酸生產菌株進行改造生產GABA的最高產量為70.6g//L。利用野生型谷氨酸棒桿菌ATCC?13032進行改造生產GABA的最高報道為38.6g/L，這種方法需要在培養基中添加抗生素以維持質粒不丟失，使生產成本增加的同時，還有可能造成抗生素對環境的污染問題，不符合綠色生產的目標。

因而，如何實現GABA的綠色生產，并保持GABA的產量能滿足工業生產的要求是目前亟待解決的問題。

發明內容

本發明通過對谷氨酸棒桿菌中的相關代謝途徑進行改造，引入了來源于Lactobacillusbrevis的谷氨酸脫羧酶基因gadB2和來源于E.coli?W3110谷氨酸脫氫酶基因gdhA和檸檬酸合酶基因gltA，并敲除了相關的基因，使得谷氨酸棒桿菌ATCC?13032在獲得合成GABA的能力的同時，還顯著提升了GABA的產量。

本發明提供了一種重組谷氨酸棒桿菌，所述谷氨酸棒桿菌表達了來源于Lactobacillusbrevis的谷氨酸脫羧酶基因gadB2、來源于E.coli?W3110谷氨酸脫氫酶基因gdhA和/或來源于E.coli?W3110的檸檬酸合酶基因gltA，敲除了基因gabP、lldD、aldB2、eutD、poxB、gabP、ldh、pknG和基因簇gabTD中的一個或多個基因，并且強化表達了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc和/或谷氨酰胺合成酶基因glnA2。