[發明專利]一種甘蔗條紋花葉病毒全長cDNA侵染性克隆構建及其應用

有效

• 申請號: 202110859921.3
• 申請日: 2021-07-28
• 公開（公告）號: CN113604500B
• 公開（公告）日: 2023-05-05
• 發明（設計）人: 王文治;沈林波;張樹珍;王俊剛;馮小艷;馮翠蓮;趙婷婷
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12N15/40;C12N1/21;C12Q1/70;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 深圳市千納專利代理有限公司 44218
• 代理人: 張新蕊

本發明提供了一種甘蔗條紋花葉病毒全長cDNA侵染性克隆載體及其構建方法和鑒定方法，所述甘蔗條紋花葉病毒全長cDNA侵染性克隆載體命名為土壤桿菌Agrobacterium?sp.，于2021年5月31日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進行保藏，保藏編號為CGMCC?No.22647。本發明將SCSMV全長cDNA序列分為A、B和C?3個重疊片段和pGreenII?35S載體D片段進行擴增，通過Gibson技術進行拼接重組轉化農桿菌，首次獲得具備侵染活性的SCSMV全長cDNA侵染性克隆載體，將加大推動SCSMV與寄主的互作機制及致病機理的研究，為開發新的SCSMV科學防控技術提供理論依據。

技術領域

本發明屬于基因工程領域，具體涉及一種甘蔗條紋花葉病毒全長cDNA侵染性克隆構建及其應用。

背景技術

病毒侵染性克隆是病毒反向遺傳學研究的基礎和前提。對于植物RNA病毒來說，侵染性克隆是具有完整生物活性的cDNA或者從cDNA克隆獲得的具有侵染力的體外轉錄RNA產物。雀麥花葉病毒是第一個被成功構建出侵染性克隆的植物RNA病毒，隨后大量的RNA病毒的侵染性克隆被成功構建，植物RNA病毒的研究獲得了快速發展。

獲得植物RNA病毒侵染性克隆，可以對cDNA克隆進行點突變，缺失突變或插入突變，可以研究病毒的基因編碼策略，研究其編碼的基因功能，研究基因組上非編碼序列對病毒基因組RNA復制和轉錄的調控等。植物RNA病毒cDNA克隆可以作為基因表達載體，開發植物生物反應器。cDNA克隆還可以用于病毒誘導的基因沉默研究(VIGS)，VIGS目前被廣泛應用于植物基因功能研究，對植物反向遺傳學研究具有很大的幫助。

甘蔗條紋花葉病毒(SCSMV)自1978年首次在美國引自巴基斯坦的甘蔗種質中檢測到，在全球范圍內迅速傳播，目前已在印度、泰國、印度尼西亞等國家廣泛發生，對當地甘蔗產業造成嚴重影響。SCSMV侵染導致甘蔗葉色失綠，葉片出現黃綠相間不規則的嵌紋、條斑或斑駁，甘蔗莖徑變小，每叢莖數減少，從而使得蔗莖產量下降，進而影響蔗糖產量(圖1)。據估計，當SCSMV發生率超過50％時，可導致蔗糖產量減少20％左右。

然而由于缺乏效果顯著的化學藥品進行防控，目前甘蔗生產上主要是通過栽培脫毒健康種苗對甘蔗病毒病進行防控。而脫毒種苗種植于大田之后，很容易重新感染病毒病而失去防控效果。因此通過構建SCSMV全長cDNA侵染性克隆對SCSMV與甘蔗之間的互作機制及致病機理進行深入的研究，有可能為開發新的SCSMV科學防控技術提供理論依據。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術中的不足，是提供一種甘蔗條紋花葉病毒(SCSMV)全長cDNA侵染性克隆載體及其構建方法和接種鑒定方法。

本發明的第一個方面是提供一種甘蔗條紋花葉病毒全長cDNA侵染性克隆載體，命名為土壤桿菌Agrobacterium?sp.，于2021年5月31日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進行保藏，保藏編號為CGMCC?No.22647。

本發明的第二個方面是提供一種如本發明第一個方面所述的甘蔗條紋花葉病毒全長cDNA侵染性克隆載體的構建方法，包括以下步驟：

(1)從感染單一甘蔗條紋花葉病毒的蔗植株葉片中提取植物總RNA；

(2)利用提取的植物總RNA獲得甘蔗條紋花葉病毒全長cDNA序列：