[發明專利]一種甘蔗條紋花葉病毒全長cDNA侵染性克隆構建及其應用

有效

• 申請號: 202110859921.3
• 申請日: 2021-07-28
• 公開（公告）號: CN113604500B
• 公開（公告）日: 2023-05-05
• 發明（設計）人: 王文治;沈林波;張樹珍;王俊剛;馮小艷;馮翠蓮;趙婷婷
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12N15/40;C12N1/21;C12Q1/70;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 深圳市千納專利代理有限公司 44218
• 代理人: 張新蕊

1.一種甘蔗條紋花葉病毒全長cDNA侵染性克隆載體，其特征在于，命名為土壤桿菌Agrobacterium?sp.，于2021年5月31日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進行保藏，保藏編號為CGMCC?No.?22647。

2.一種如權利要求1所述的甘蔗條紋花葉病毒全長cDNA侵染性克隆載體的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）從感染單一甘蔗條紋花葉病毒的蔗植株葉片中提取植物總RNA；

（2）利用提取的植物總RNA獲得甘蔗條紋花葉病毒全長cDNA序列：

（3）以獲得的序列為基礎，并結合表達載體pGreenII-35S序列，分別設計甘蔗條紋花葉病毒全長cDNA序列的A片段、B片段和C片段三個重疊片段以及pGreenII-35S載體D片段的4對引物，對A片段、B片段、C片段和D片段進行擴增，其中，A片段的序列為SEQ?ID?NO.1所述序列的第2388bp至第5583bp，B片段的序列為SEQ?ID?NO.1所述序列的第5564bp至第8982bp，C片段的序列為SEQ?ID?NO.1所述序列的第8755bp至第12226bp，D片段的序列如SEQ?IDNO.18所示，A片段的引物對的序列如SEQ?ID?NO.2和SEQ?ID?NO.3所示，B片段的引物對的序列如SEQ?ID?NO.4和SEQ?ID?NO.5所示，C片段的引物對的序列如SEQ?ID?NO.6和SEQ?IDNO.7所示，D片段的引物對的序列如SEQ?ID?NO.8和SEQ?ID?NO.9所示；

（4）將擴增獲得的A片段、B片段、C片段和D片段經Gibson技術拼接重組后直接轉化具有輔助質粒pSoup的GV3101農桿菌感受態，挑單克隆進行測序鑒定，測序鑒定正確的克隆載體即為成功構建的甘蔗條紋花葉病毒全長cDNA侵染性克隆載體。

3.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于，步驟（2）具體為：

根據已有的SCSMV全長參考序列設計PCR擴增引物，將SCSMV全長基因組分為片段1、片段2、片段3三個重疊大片段分別進行克隆測定，并且通過5'?RACE和3'?RACE技術，對5'端和3'端的序列進行測序確認，測序結果經拼接，獲得完整的SCSMV全長cDNA序列信息，

其中，片段1的序列為SEQ?ID?NO.1所述序列的第2413bp至第5650bp，片段2的序列為SEQ?ID?NO.1所述序列的第5495bp至第9063bp，片段3的序列為SEQ?ID?NO.1所述序列的第8755bp至第12193bp，片段1的引物對的序列如SEQ?ID?NO.10和SEQ?ID?NO.11所示，片段2的引物對的序列如SEQ?ID?NO.12和SEQ?ID?NO.13所示，片段3的引物對的序列如SEQ?IDNO.14和SEQ?ID?NO.15所示。

4.一種如權利要求1所述的甘蔗條紋花葉病毒全長cDNA侵染性克隆載體的鑒定方法，其特征在于，將所述克隆載體進行活化培養后，接種至無毒甘蔗單芽莖節，將單芽莖節種植，長出小苗后剪取幼嫩葉片組織提取總RNA，用甘蔗條紋花葉病毒的特異檢測引物F:ACAAGGAACGCAGCCACCT和R:?ACTAAGCGGTCAGGCAAC進行RT-PCR檢測，與經鑒定確認感染SCSMV病毒的陽性植株檢測結果一致，說明獲得了具備侵染活性的甘蔗條紋花葉病毒全長cDNA侵染性克隆載體。

5.根據權利要求4所述的鑒定方法，其特征在于，活化培養所用培養基為YEP固體平板培養基及MR液體培養基。

6.一種引物對，其特征在于，所述的引物對的序列如SEQ?ID?NO.2和SEQ?ID?NO.3所示的引物對，或者其為如SEQ?ID?NO.4和SEQ?ID?NO.5所示的引物對，或者其為如SEQ?ID?NO.6和SEQ?ID?NO.7所示的引物對，或者其為如SEQ?ID?NO.8和SEQ?ID?NO.9所示的引物對。

7.如權利要求6所述的引物對在構建權利要求1所述的甘蔗條紋花葉病毒全長cDNA侵染性克隆載體中的應用。

8.一種引物對在鑒定權利要求1所述的甘蔗條紋花葉病毒全長cDNA侵染性克隆載體中的應用，所述引物對組成為：F:?ACAAGGAACGCAGCCACCT和R:?ACTAAGCGGTCAGGCAAC。