[發明專利]一種實現多重RNA原位檢測的原位測序文庫的構建方法

在審

• 申請號: 202110853579.6
• 申請日: 2021-07-27
• 公開（公告）號: CN113463203A
• 公開（公告）日: 2021-10-01
• 發明（設計）人: 柯榮秦;謝丹琳;林辰;邵慧
• 申請（專利權）人: 華僑大學
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C12Q1/6869
• 代理公司: 廈門市首創君合專利事務所有限公司 35204
• 代理人: 張松亭;姜謐

1.一種實現多重RNA原位檢測的原位測序文庫的構建方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)根據目標RNA上的靶序列設計至少一識別探針對；每一識別探針對由一上游識別探針和一下游識別探針組成，上游識別探針含有上游標簽序列，下游識別探針含有下游標簽序列，上游標簽序列和下游標簽序列組成一完整標簽序列用于解讀其對應的靶序列；

(2)將上述至少一識別探針對輸送入細胞內，使其與上述目標RNA上的靶序列識別并雜交，其中上游識別探針的3’端與下游識別探針的5’端相互靠近，通過能夠以RNA為模板連接DNA的DNA連接酶相連形成至少一鏈狀DNA分子；

(3)將步驟(2)所得的至少一鏈狀DNA分子與DNA夾板序列雜交，使該至少一鏈狀DNA分子的5‘端和3’端靠近，再通過DNA連接酶相連形成至少一環狀DNA分子；

(4)以該至少一環狀DNA分子為模板進行滾環擴增，獲得擴增產物，即所述原位測序文庫，通過原位測序技術可以對該原位測序文庫中的不同的標簽進行解碼，獲得每一擴增產物上的完整標簽序列，進而得知不同擴增產物檢測的目標RNA的種類，從而獲得不同目標RNA的原位表達信息，實現多重RNA原位檢測。

2.如權利要求1所述的構建方法，其特征在于：所述目標RNA包括細胞本身的RNA和外源性基因在細胞內部表達的RNA。

3.如權利要求1所述的構建方法，其特征在于：所述DNA連接酶為Splint R連接酶。

4.如權利要求1所述的構建方法，其特征在于：所述細胞為游離的待測細胞或組織內的細胞。

5.如權利要求1所述的構建方法，其特征在于：所述目標RNA包括細胞本身的RNA和外源性基因在細胞內部表達的RNA，所述細胞為游離的待測細胞或組織內的細胞。

6.如權利要求1所述的構建方法，其特征在于：所述目標RNA包括細胞本身的RNA和外源性基因在細胞內部表達的RNA，所述DNA連接酶為Splint R連接酶。

7.如權利要求1所述的構建方法，其特征在于：所述細胞為游離的待測細胞或組織內的細胞，所述DNA連接酶為Splint R連接酶。

8.如權利要求1所述的構建方法，其特征在于：所述目標RNA包括細胞本身的RNA和外源性基因在細胞內部表達的RNA，所述細胞為游離的待測細胞或組織內的細胞，所述DNA連接酶為Splint R連接酶。