[發明專利]一種實現多重RNA原位檢測的原位測序文庫的構建方法

在審

• 申請號: 202110853579.6
• 申請日: 2021-07-27
• 公開（公告）號: CN113463203A
• 公開（公告）日: 2021-10-01
• 發明（設計）人: 柯榮秦;謝丹琳;林辰;邵慧
• 申請（專利權）人: 華僑大學
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C12Q1/6869
• 代理公司: 廈門市首創君合專利事務所有限公司 35204
• 代理人: 張松亭;姜謐

本發明公開了一種實現多重RNA原位檢測的原位測序文庫的構建方法，利用特殊設計的核酸探針技術構建了原位測序文庫，利用原位測序技術和熒光顯微成像技術實現了高度多重的RNA原位檢測；將完整標簽序列放置于識別探針對的兩條鏈上，與放置于整個標簽放置于一端相比，縮短了測序位置與連接位置的平均距離，提高了信號強度和特異性。

技術領域

本發明屬于RNA原位表達分析技術領域，具體涉及一種實現多重RNA原位檢測的原位測序文庫的構建方法。

背景技術

空間轉錄組學是近年來新興的基因表達分析技術，其是指一系列能夠在空間上實現對基因進行定位和定量的分析的技術。目前的空間轉錄組學方法主要分為基于顯微成像的方法以及基于測序的方法兩大類。前者有原位測序技術、基于單分子熒光原位雜交的編碼技術，后者則是一系列基于微陣列的引物編碼尋址方法。

原位測序技術是一種依賴于新一代測序化學技術實現對多種基因表達進行原位分析的空間轉錄組學技術，可以分為全轉錄組原位測序與靶向原位測序，后者需要利用探針構建原位測序文庫。該技術主要是通過在細胞或者組織中對來自單個RNA分子的信號進行多輪的測序，從而得到一串由不同顏色熒光編碼的信號來檢測不同的基因。以原位測序為代表的空間轉錄組學技術主要包括原位測序技術、熒光原位測序技術技術(FISSEQ)以及STARmap(spatially-resolved transcript amplicon readout mapping)技術。FISSEQ則不利用探針進行靶向檢測，而是采取類似下一代測序技術的方法直接將RNA在原位逆轉錄為cDNA后環化擴增，接著直接在細胞內進行較長片段的原位測序化學，從而得到一系列的基因序列片段來實現多重RNA原位檢測。原位測序和STARmap技術都是基于鎖式探針進行目標短序列的捕獲或者利用帶標簽的鎖式探針對不同基因進行編碼從而實現同時檢測，該技術測序由于測序長度較短(4-6nt)，因此所能同時檢測的目標基因比較有限(4的N次方種標簽)。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術缺陷，提供一種實現多重RNA原位檢測的原位測序文庫的構建方法。

本發明的技術方案如下：

一種實現多重RNA原位檢測的原位測序文庫的構建方法，包括如下步驟：

(1)根據目標RNA上的靶序列設計至少一識別探針對；每一識別探針對由一上游識別探針和一下游識別探針組成，上游識別探針含有上游標簽序列，下游識別探針含有下游標簽序列，上游標簽序列和下游標簽序列組成一完整標簽序列用于解讀其對應的靶序列；

(2)將上述至少一識別探針對輸送入細胞內，使其與上述目標RNA上的靶序列識別并雜交，其中上游識別探針的3’端與下游識別探針的5’端相互靠近，通過DNA連接酶相連形成至少一鏈狀DNA分子；

(3)將步驟(2)所得的至少一鏈狀DNA分子與DNA夾板序列雜交，使該至少一鏈狀DNA分子的5‘端和3’端靠近，再通過DNA連接酶相連形成至少一環狀DNA分子；

(4)以該至少一環狀DNA分子為模板進行滾環擴增，獲得擴增產物，即所述原位測序文庫，通過原位測序技術可以對該原位測序文庫中的不同的標簽進行解碼，獲得每一擴增產物上的完整標簽序列，進而得知不同擴增產物檢測的目標RNA的種類，從而獲得不同目標RNA的原位表達信息，實現多重RNA原位檢測。

在本發明的一個優選實施方案中，所述目標RNA包括細胞本身的RNA和外源性基因在細胞內部表達的RNA。

在本發明的一個優選實施方案中，所述DNA連接酶為Splint R連接酶。

在本發明的一個優選實施方案中，所述細胞為游離的待測細胞或組織內的細胞。

在本發明的一個優選實施方案中，所述目標RNA包括細胞本身的RNA和外源性基因在細胞內部表達的RNA，所述細胞為游離的待測細胞或組織內的細胞。