[發明專利]一種串聯雙促溶標簽及其應用

在審

• 申請號: 202110851968.5
• 申請日: 2021-07-27
• 公開（公告）號: CN113637698A
• 公開（公告）日: 2021-11-12
• 發明（設計）人: 雷苗;孫秋菊
• 申請（專利權）人: 武漢菲恩生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/62;C12N15/66;C07K1/22
• 代理公司: 武漢紅觀專利代理事務所(普通合伙) 42247
• 代理人: 王昌亮

本發明提出了一種串聯雙促溶標簽，包括促溶標簽IF2DI和SUMO以及內含肽Mxe，本發明同時采用IF2DI和SUMO兩個促溶標簽組成雙促溶表達標簽，相對于單一的標簽，可以更好促進目的蛋白的正確折疊并提高表達量，克服了單一標簽蛋白折疊不好，促溶效果不理想的情況；且內含肽Mxe剪接后末端沒有多余的氨基酸序列，提高了目的蛋白的純度。

技術領域

本發明涉及蛋白表達純化領域，尤其涉及一種串聯雙促溶標簽及其應用。

背景技術

重組蛋白的原核表達目前已被廣泛應用，其優點是能夠在短時間內獲得大量基因表達產物，所需成本相對低廉。為了能夠進行后續的結構功能研究，所獲得的重組蛋白必須可溶，穩定，正確折疊以及具有生物活性。原核表達的缺點是表達出來的蛋白缺乏翻譯后加工，導致不正確的蛋白折疊形成不溶性包涵體，需要經過復雜的變性復性處理，很難表達大量的可溶外源蛋白。重組蛋白表達的可溶性成為首要解決的問題，促溶標簽常被用于促進重組蛋白的可溶性表達。

促溶標簽IF2DI來源于大腸桿菌，分子量18kDa，對蛋白的結構影響小，具有很高的親水性，可在不同的宿主中表達，適用范圍廣，促溶效率高。小泛素樣修飾蛋白SUMO來源于啤酒酵母，分子量11.5kDa，不但可以進一步提高融合蛋白的表達量，還能抗蛋白酶水解和促進目的蛋白正確折疊，提高重組蛋白的穩定性和可溶性。促溶標簽IF2DI與SUMO串聯融合表達可以顯著促進目的蛋白的可溶性表達。但是促溶標簽IF2DI與SUMO在表達CD138時，蛋白酶或凝血酶酶切促溶標簽IF2DI與SUMO時，目的蛋白的末端常殘留有多余的氨基酸序列，從而影響目的蛋白的純度。

發明內容

有鑒于此，本發明提出了一種可以避免包涵體，同時也無需引入蛋白酶酶切，能夠得到序列天然的目標產物的IF2DI和SUMO串聯雙促溶表達標簽序列。

本發明的技術方案是這樣實現的：一方面，本發明提供了一種串聯雙促溶標簽，包括促溶標簽IF2DI和SUMO以及內含肽Mxe。

在以上技術方案的基礎上，優選的，所述促溶標簽IF2DI的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；所述促溶標簽SUMO的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述內含肽Mxe的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

另一方面，提供了一種串聯雙促溶標簽在蛋白表達純化中的應用，包括如下步驟：

S1，構建表達載體pET28a-IF2DI-SUMO-Mxe；

S2，將目的基因X插入表達載體pET28a-IF2DI-SUMO-Mxe的HindIII和XhoI酶切位點之間；

S3，將插入目的基因的表達載體pET28a-IF2DI-SUMO-Mxe-X轉入表達菌株中，誘導表達；

S4，誘導后破碎菌株細胞，進行可溶蛋白的鎳柱親和純化，得到純合的目的蛋白。

在以上技術方案的基礎上，優選的，步驟S3所述誘導表達采用IPTG作為誘導劑。

在以上技術方案的基礎上，優選的，步驟S1的表達載體采用PCR及酶切連接方法，將IF2DI、SUMO和Mxe序列連接，并插入pET28a載體，獲得pET28a-IF2DI-SUMO-Mxe載體。

在以上技術方案的基礎上，優選的，所述IF2DI促溶標簽插入pET28a載體的方法為：人工合成IF2DI基因序列，并將該基因插入pET28a載體的NcoI和NdeI酶切位點之間，構建表達載體pET28a-IF2DI，并將載體轉化到大腸桿菌DH5a感受態細胞中。