[發(fā)明專利]還原酶LX05基因，含有該基因的基因工程菌及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110851734.0
• 申請日: 2021-07-27
• 公開（公告）號(hào): CN113388627B
• 公開（公告）日: 2022-04-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王能強(qiáng)
• 申請（專利權(quán)）人: 湖南科技大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/53
• 分類號(hào): C12N15/53;C12N9/04;C12N15/70;C12N1/21;C12P7/22;C12R1/19
• 代理公司: 湘潭市匯智專利事務(wù)所(普通合伙) 43108
• 代理人: 冷玉萍

本發(fā)明公開一種還原酶LX05基因，含有該基因的工程菌及其應(yīng)用。所述還原酶LX05基因的核苷酸序列為SEQID NO.1；所述還原酶LX05基因所編碼的還原酶蛋白質(zhì)的氨基酸序列為SEQ ID NO.2。將還原酶LX05基因構(gòu)建重組質(zhì)粒再導(dǎo)入E.coliBL21(DE3)即獲得含有該基因的基因工程菌。所述還原酶LX05基因編碼的還原酶蛋白質(zhì)或含有該還原酶基因的基因工程菌在合成手性化合物(優(yōu)選(R)?[3,5?二(三氟甲基)苯基]乙醇)具有立體選擇性好、催化活性高和產(chǎn)物光學(xué)純度高等特性，且能實(shí)現(xiàn)高濃度(768g/L)底物的轉(zhuǎn)化。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程，具體涉及還原酶LX05基因，含有該基因的基因工程菌及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

手性化合物是一類重要的手性模塊化合物，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化工和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。利用還原酶或其全細(xì)胞不對稱還原潛手性羰基化合物是制備光學(xué)活性手性化合物的有效途徑。還原酶是一類以NAD(P)H為輔酶、在酶學(xué)分類上屬于短鏈脫氫酶/還原酶類的氧化還原酶，因其具有高化學(xué)選擇性、高區(qū)域選擇性和立體選擇性，被認(rèn)為是一類極具潛力的用于不對稱催化還原反應(yīng)的生物催化劑。然而，大多數(shù)已知的還原酶在催化制備手性化合物時(shí)存在催化活性較低、反應(yīng)效率低下、底物初始濃度不高、熱穩(wěn)定性差、適用底物種類有限、有機(jī)溶劑耐受性差、水相溶解度低等問題，這些問題的存在嚴(yán)重制約著當(dāng)前生物催化在工業(yè)上廣泛應(yīng)用，這些存在的問題可以通過選擇高效、合適的還原酶催化劑來克服。因此，尋找具有優(yōu)良特性的新型還原酶催化劑已成為必要，而且開發(fā)出新型、高效的還原酶催化劑還可以豐富微生物還原酶庫，為生物催化制備功能手性化合物提供新酶源，為手性藥物中間體的制備提供高效、綠色的生物催化劑。

(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇是合成用于治療癌癥病人化療時(shí)減少嘔吐和延遲性嘔吐的藥物阿瑞吡坦和NK-1受體拮抗劑的重要手性中間體。制備(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基] 乙醇的方法有化學(xué)法合成、酶法拆分和生物催化的不對稱還原等，基于還原酶或其全細(xì)胞為生物催化劑的不對稱還原法具有立體選擇性高、反應(yīng)條件溫和，副產(chǎn)物少和產(chǎn)率高等優(yōu)點(diǎn)，越來越備受研究者關(guān)注。近年來，一些具有不對稱還原制備(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基] 乙醇的還原酶或含還原酶的微生物細(xì)胞已被報(bào)道，如Leifsonia xyli，Lactobacillus kefir、 Penicillium expansum、Microbacterium oxydans、Trichodermaasperellum ZJPH0801、 Chryseobacterium sp.CA49、Burkholderia cenocepacia和固定化的酮還原酶等。然而，這些還原酶或微生物在催化過程中大多數(shù)的底物濃度不高、產(chǎn)物濃度低和反應(yīng)時(shí)間較長，不適合用于工業(yè)化生產(chǎn)(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇。

發(fā)明內(nèi)容

針對已報(bào)道大多數(shù)還原酶催化制備手性化合物(如(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇)時(shí)存在催化活性偏低、底物耐受性差、底物初始濃度低、產(chǎn)物濃度不夠高，以及需要額外添加昂貴輔酶、反應(yīng)時(shí)間長等問題，本發(fā)明提供一種催化活性高、對映選擇性強(qiáng)、底物耐受性好、反應(yīng)時(shí)間短、無需額外添加輔酶的還原酶LX05基因，含有還原酶LX05基因的基因工程菌，以及還原酶LX05基因編碼的還原酶蛋白質(zhì)，或含有還原酶LX05基因的基因工程菌在催化還原制備手性化合物中的應(yīng)用。特別地，將該酶用于(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的制備中，不僅催化活性高、底物耐受性好、產(chǎn)物濃度高、催化反應(yīng)時(shí)間短，而且實(shí)現(xiàn)了高濃度(768g/L) 底物的轉(zhuǎn)化。

本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種還原酶LX05基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO.1，所述還原酶LX05基因全長(從起始密碼子到終止密碼子)為756bp，G+C含量為70.94％，編碼251個(gè)氨基酸，所述氨基酸序列為：SEQ ID NO.2。

所述的還原酶LX05基因核苷酸序列所編碼的還原酶蛋白質(zhì)，所述還原酶蛋白質(zhì)的氨基酸序列為：SEQ ID NO.2。

SEQID NO.1：