[發(fā)明專利]還原酶LX05基因，含有該基因的基因工程菌及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110851734.0
• 申請日: 2021-07-27
• 公開（公告）號: CN113388627B
• 公開（公告）日: 2022-04-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王能強(qiáng)
• 申請（專利權(quán)）人: 湖南科技大學(xué)
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/04;C12N15/70;C12N1/21;C12P7/22;C12R1/19
• 代理公司: 湘潭市匯智專利事務(wù)所(普通合伙) 43108
• 代理人: 冷玉萍

1.一種還原酶LX05基因，其特征在于，所述還原酶LX05基因的核苷酸序列為SEQ IDNO.1，所述基因全長為756 bp，G+C 含量為70.94%，編碼251個氨基酸，其氨基酸序列為：SEQID NO.2。

2.權(quán)利要求1所述的還原酶LX05基因所編碼的還原酶蛋白質(zhì)，其特征在于，所述還原酶蛋白質(zhì)的氨基酸序列為：SEQ ID NO.2。

3.一種含有權(quán)利要求1所述的還原酶LX05基因的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌為基因工程菌E.coli BL21(DE3)-LX05，所述基因工程菌的重組表達(dá)載體為pET-28a(+)，與載體連接的酶切位點為NcoⅠ和HindⅢ，重組表達(dá)菌株的宿主細(xì)胞為E.coli BL21(DE3)。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述的基因工程菌E.coli BL21(DE3) 的構(gòu)建方法為：含有權(quán)利要求1所述的還原酶LX05基因的pET-28a(+) 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌E.coli BL21(DE3) 獲得重組基因工程菌E.coli BL21(DE3)，再將所獲得的重組基因工程菌E.coli BL21(DE3) 轉(zhuǎn)接到含50 μg/mL卡那霉素的平板，37℃培養(yǎng)16h 后，挑取單菌落轉(zhuǎn)化子，經(jīng)測序驗證基因序列無誤后，保存。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述的基因工程菌E.coli BL21(DE3)-LX05，按如下方法培養(yǎng)獲得：取一定量的基因工程菌E.coli BL21(DE3)-LX05加入到裝有50mL L-B培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，37℃、150-250rpm，培養(yǎng)8-12 h；然后取1mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至裝有100mL新鮮L-B培養(yǎng)基的500mL搖瓶中，37℃、150-250rpm，培養(yǎng)1-2h后，無菌條件下往搖瓶中添加終濃度為0-0.7 mmol/L的誘導(dǎo)劑IPTG，17-37℃、150-250rpm，繼續(xù)培養(yǎng)6-20h，將培養(yǎng)液離心，獲得基因工程菌濕菌體。

6.權(quán)利要求1所述的還原酶LX05基因、權(quán)利要求2所述的還原酶蛋白質(zhì)或權(quán)利要求3所述的基因工程菌的應(yīng)用，其特征在于，所述的還原酶LX05基因、還原酶蛋白質(zhì)或基因工程菌用于制備手性化合物，所述的手性化合物為(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，以[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙酮為底物，以還原酶LX05基因編碼的還原酶蛋白質(zhì)或權(quán)利要求5所述的方法獲得的基因工程菌濕菌體為酶源，于體積分?jǐn)?shù)為0-75%的異丙醇、0-5 mmol/L的NAD⁺、0-3 mmol/L的MgCl₂、20-400 g/L的濕菌體、100-3000 mmol/L的底物[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙酮和pH為6.2-8.0的緩沖液或蒸餾水構(gòu)成的反應(yīng)體系中，在25-35℃條件下進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)液加入乙酸乙酯或正己烷萃取10-30min，然后離心收集上層的乙酸乙酯萃取液，萃取液中的產(chǎn)物和未反應(yīng)底物的濃度采用氣相色譜分析，用內(nèi)標(biāo)法定量。