[發明專利]快速檢測金黃色葡萄球菌、沙門氏菌或/和志賀氏菌的LAMP引物及方法

在審

• 申請號: 202110842632.2
• 申請日: 2021-07-26
• 公開（公告）號: CN113462798A
• 公開（公告）日: 2021-10-01
• 發明（設計）人: 徐璇;趙旭歡;呂秀龍;張影;何倩;付詩琪;吉芳英
• 申請（專利權）人: 重慶大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/14;C12Q1/10;C12N15/11;C12R1/445;C12R1/42;C12R1/01
• 代理公司: 重慶華科專利事務所 50123
• 代理人: 吳興偉

本發明涉及分子生物學檢測技術領域，特別是涉及快速檢測金黃色葡萄球菌、沙門氏菌或/和志賀氏菌的LAMP引物及方法。快速檢測金黃色葡萄球菌、沙門氏菌或/和志賀氏菌的LAMP引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.1~6、SEQ ID No.19～24或/和SEQ ID No.37～42所示。通過引物濃度配比實驗確定三重LAMP反應體系引物濃度，進而建立三重LAMP檢測方法。本發明提供的LAMP引物可以實現金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、志賀氏菌的快速檢測及高度特異性檢測。本發明建立的三重LAMP檢測方法可以有效解決單重LAMP反應檢測通量低和假陽性的問題。

技術領域

本發明涉及分子生物學檢測技術領域，特別是涉及快速檢測金黃色葡萄球菌、沙門氏菌或/和志賀氏菌的LAMP引物及方法。

背景技術

目前，病原微生物檢測領域應用比較廣泛的檢測方法主要有生化法、免疫學方法、分子生物學技術、代謝學技術等。其中分子生物學技術中的環介導等溫擴增技術(LAMP)具有操作簡單、無需大型儀器設備、成本低廉、反應時間短、結果判定簡單、比常規分子生物學方法具有更高的靈敏度和特異性等優點而受到廣泛關注。LAMP僅需普通水浴鍋就能快速、高效、簡便地對病原微生物進行鑒定，因而具有推廣性，可以作為常規的檢測工具。對設施簡陋、經濟狀況較差、無法使用昂貴的大型檢測儀器的偏遠地區或鄉村來說，建立一種快速、準確、靈敏、操作簡便的病原微生物檢測技術十分關鍵。

LAMP是一種利用具有鏈置換特性的DNA聚合酶對識別的核酸序列進行催化擴增的新型技術。該技術的核心要點是能特異性識別目的基因保守片段的4條或6條引物以及具有鏈置換特性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)。除此之外反應體系還包括dNTPs、模板DNA、Mg²⁺、甜菜堿等。LAMP反應是一種等溫條件下的核酸擴增反應，通過在60℃左右保持幾十分鐘，即可完成反應，陽性結果中，LAMP體系的DNA擴增鏈式循環產生大量目的基因片段，產生反應副產物焦磷酸鎂白色沉淀，可根據濁度結果判定反應結果。

LAMP技術也有一些缺陷限制了其應用于實際場景中，例如假陽性結果和檢測通量。單重LAMP只能檢測單一基因片段，其效率已不足以滿足當前的眾多需求，且多種病原菌的單重LAMP檢測步驟具有大量的重復性，逐個單一檢測耗時耗力；LAMP方法是基于DNA擴增的一種技術手段，死菌的DNA也可能被擴增，因此LAMP假陽性結果的來源可能是目標死菌。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是，克服常規技術普遍存在的操作復雜，價格昂貴，需要大型儀器，耗時長。

本發明的技術方案快速檢測金黃色葡萄球菌、沙門氏菌或/和志賀氏菌的LAMP引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.1～6、SEQ ID No.19～24或/和SEQ ID No.37～42所示。

本發明還提供了快速檢測金黃色葡萄球菌、沙門氏菌或/和志賀氏菌的方法，包括如下步驟：

步驟1、采用疊氮溴乙錠對樣本進行前處理，用磁珠法提取DNA；

步驟2、向步驟1提取好的DNA樣本中加入LAMP反應體系，所述LAMP反應體系為單重反應體系或三重反應體系，所述單重反應體系包括1套nuc引物、1套invA引物或1套ipaH引物，10×LAMP buffer，dNTPs，Betaine，8U Bst DNA聚合酶，DNA模板，ddH₂O，反應pH為8.8；所述三重反應體系包括1套nuc引物、1套invA引物和1套ipaH引物，10×LAMP buffer，dNTPs，Betaine，8U Bst DNA聚合酶，DNA模板，ddH₂O，反應pH為8.8；1套nuc引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1～6所示，1套invA引物核苷酸序列如SEQ ID No.19～24所示；1套ipaH引物核苷酸序列如SEQ ID No.37～42所示；

步驟3、將步驟2所得產物進行通過濁度儀進行檢測。