[發明專利]一種新金色分枝桿菌中基因連續敲除的方法

在審

• 申請號: 202110841851.9
• 申請日: 2021-07-26
• 公開（公告）號: CN113481137A
• 公開（公告）日: 2021-10-08
• 發明（設計）人: 許敬亮;趙安琪;李亞梅;張曉琴;王小元;胡曉清;應漢杰;呂永坤;阿拉牧
• 申請（專利權）人: 鄭州大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/90;C12N15/74;C12N15/65;C12N15/55;C12N15/66;C12R1/32
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本發明公開了一種新金色分枝桿菌(Mycolicibacterium neoaurum)基因連續敲除方法，屬于基因工程技術領域。本發明建立了基于同源重組?Cre/loxLR特異位點重組的M.neoaurum基因敲除方法。包括如下步驟：首先構建敲除片段并轉入M.neoaurum，利用同源重組將基因組上的靶基因替換為兩端帶有loxL和LoxR位點的kan片段；然后轉入質粒pDMN01，由重組酶Cre識別loxL和LoxR位點并發生重組反應，從而去除kan基因片段；進一步利用質粒的溫敏特性將pDMN01消除。本發明的敲除方法，相較于傳統的基于同源重組雙交換的分枝桿菌敲除方法，可有效縮短篩選的時長和減少篩選的工作量。

技術領域

本發明涉及一種基于同源重組-Cre/loxLR特異位點重組的新金色分枝桿菌(Mycolicibacterium neoaurum)基因連續敲除方法，屬于基因工程技術領域。

背景技術

M.neoaurum被廣泛應用于生產甾藥中間體，基因工程和代謝工程是改造菌株提高甾藥中間體產量的重要手段，因此，M.neoaurum中進行遺傳操作方法的開發和改良，特別是構建基因連續敲除方法，對于甾藥中間體生產菌株的構建具有重要意義。但是，相對于基因工程研究常用的腸桿菌和枯草芽孢桿菌，目前分枝桿菌遺傳操作工具發展較為滯后。

DNA分子的同源重組廣泛存在于各類生物中，是遺傳信息重新組合的重要方式。同源重組主要是依賴于片段或是載體與目標基因存在一定相同的同源DNA序列，經過同源區的配對和鏈斷裂、再接產生交換，完成DNA重組。基于DNA同源重組的原開發的基因敲除系統，被廣泛用于微生物的基因編輯中。目前，分枝桿菌中基因敲除常用系統是p2NIL/pGOAL19，該系統是基于同源重組雙交換-SacB反篩的原理開發的。該系統需要在整合型質粒的幫助下通過兩輪的交換才能完成靶標基因的同源重組；該方法雙交換的概率低，耗時久，篩選工作量大。Cre/loxP特異位點重組酶系統也可通過與同源重組組合用于基因的連續敲除。Cre是一種位點特異性重組酶，能介導兩個loxP位點之間的序列刪除、倒位和易位。當兩個loxP位點位于一條DNA鏈上且方向相同時，Cre能切除兩個loxP位點間的序列，并在DNA鏈上留下一個loxP位點。loxL和loxR是突變的loxP位點，兩個重組位點經過Cre酶重組后，產生一個不能再被Cre重組酶識別的位點loxLR，該位點不再參與位點重組。

本發明建立的基于同源重組-Cre/loxLR特異位點重組的分枝桿菌敲除方法，是在通過同源重組將基因組上的靶基因替換為兩端帶有重組位點的kan片段的基礎上，利用重組酶Cre特異性識別loxL和loxR序列發生重組反應，刪除loxL和loxR位點間的抗性標簽，而后利用溫敏特性消除工具質粒(見附圖1)。該系統可用于M.neoaurum中基因的連續敲除。相較于由質粒p2NIL和pGOAL19組成的傳統的分枝桿菌敲除系統，本發明構建的敲除方法可有效縮短篩選時長，減少篩選的工作量，顯著提高敲除效率。

發明內容

本發明提供了一種M.neoaurum中基因連續敲除的方法，該方法綜合利用了同源重組和Cre/loxLR特異性位點重組技術，相較于目前的分枝桿菌中常用的p2NIL和pGOAL19敲除系統，本發明可有效縮短篩選的時長，減少篩選的工作量，從而提高基因敲除的效率。本發明所述敲除系統可簡便高效地實現M.neoaurum中基因連續敲除，敲除后菌株不攜帶任何質粒和抗生素標簽。在M.neoaurum的Cre/loxLR特異位點重組過程中，本發明構建的工具質粒pDMN01發揮重要作用。pDMN01含有分枝桿菌組成型啟動子hsp60并由該啟動子控制重組酶Cre的表達，以及分枝桿菌的溫敏復制子pAL5000^ts(見附圖2)。該質粒表達的Cre識別loxL和LoxR位點并發生重組反應，從而用于去除kan基因片段；該質粒的溫敏啟動子在39℃以上的培養溫度下活性喪失，因此可通過高溫下傳代培養實現有效質粒丟失。

本發明主要通過以下步驟實現(見附圖1)：