[發明專利]一種新金色分枝桿菌中基因連續敲除的方法在審
| 申請號： | 202110841851.9 | 申請日： | 2021-07-26 |
| 公開（公告）號： | CN113481137A | 公開（公告）日： | 2021-10-08 |
| 發明（設計）人： | 許敬亮;趙安琪;李亞梅;張曉琴;王小元;胡曉清;應漢杰;呂永坤;阿拉牧 | 申請（專利權）人： | 鄭州大學 |
| 主分類號： | C12N1/21 | 分類號： | C12N1/21;C12N15/90;C12N15/74;C12N15/65;C12N15/55;C12N15/66;C12R1/32 |
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| 地址： | 450001 河南省鄭*** | 國省代碼： | 河南;41 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 金色 分枝桿菌 基因 連續 方法 | ||
1.一種新金色分枝桿菌(Mycolicibacterium neoaurum)的基因連續敲除方法，其特征在于包括如下步驟：
(1)提取M.neoaurum基因組DNA，PCR分別擴增靶基因的上游和下游基因片段，將靶基因上游片段、兩端帶有loxL和LoxR位點的kan片段和靶基因下游片段相連接構成靶基因敲除片段；
(2)將敲除片段轉入M.neoaurum感受態中，通過同源重組將基因組上的靶基因替換為兩端帶有loxL和LoxR位點的kan片段；
(3)將工具質粒pDMN01轉入步驟3)篩選得到的陽性轉化子的感受態中，由pDMN01上的重組酶Cre識別loxL和loxR位點并發生重組反應，從而去除kan基因片段；
(4)利用質粒pDMN01的溫敏特性將其移出細胞。
2.權利要求1所述敲除方法中使用的工具質粒pDMN01(核苷酸序列見SEQ ID NO.01)，其特征在于含有分枝桿菌溫敏復制子pAL5000ts、潮霉素抗性基因hygR和帶有hsp60啟動子的重組酶編碼基因cre。
3.權利要求2所述工具質粒pDMN01的構建方法，其特征在于包括如下步驟：
(1)以質粒pYS1為模板，PCR擴增分枝桿菌溫敏復制子pAL5000ts。片段經過酶切純化后與經過同樣處理的質粒pUC57連接，得到重組質粒pDX1；
(2)以質粒pDTW109為模板，PCR擴增重組酶編碼基因cre。片段經過酶切純化后與經過同樣處理的pMV261連接，得到重組質粒pDX2；
(3)以pDX2為模板，PCR擴增片段hsp60-cre，片段經過酶切純化后與經過同樣處理的pDX1連接，得到重組質粒pDX3；
(4)使用Kpn I酶切質粒pGOAL19，獲得潮霉素抗性基因hygR，片段經過酶切純化后與經過同樣處理的pDX3連接，得到重組質粒pDMN01。
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