[發(fā)明專(zhuān)利]基于γ-分泌酶激活蛋白基因的干燥綜合征動(dòng)物模型的建立方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110835547.3
• 申請(qǐng)日: 2021-07-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113558011B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-05-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 賈二濤;張劍勇
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 深圳市中醫(yī)院
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/90
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/90
• 代理公司: 深圳市深弘廣聯(lián)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 44449
• 代理人: 向用秀

本發(fā)明公開(kāi)了一種基于γ?分泌酶激活蛋白基因的干燥綜合征動(dòng)物模型的建立方法，小鼠Gsap基因位于小鼠5號(hào)染色體上；外顯子5將被選為目標(biāo)位點(diǎn)；將小鼠Gsap基因的gRNA、含P118T(CCA?to?ACA)突變位點(diǎn)的供體寡核苷酸和cas9mRNA一起注射到受精卵中產(chǎn)生靶向敲除子代；用PCR方法鑒定F0代小鼠，并進(jìn)行序列分析，將其育成野生型小鼠，進(jìn)行種系傳遞和F1代動(dòng)物的研究。本發(fā)明不僅具有高效、快速、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)，而且極易推廣并廣泛使用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種基于γ-分泌酶激活蛋白基因的干燥綜合征動(dòng)物模型的建立方法。

背景技術(shù)

原發(fā)干燥綜合征(pSS)是一種主要侵犯外分泌腺為主要特征的慢性炎癥性自身免疫性疾病，在中醫(yī)學(xué)方面，pSS屬“燥證”、“燥病”等范疇，以口眼干燥為主癥，隨著疾病的進(jìn)展，可造成多器官、多系統(tǒng)受累。pSS患病率為0.1％-1％，僅次于類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎居第二位，男女比例為1:9。其發(fā)病機(jī)制不明，pSS被認(rèn)為是一個(gè)起源于遺傳因素與能夠觸發(fā)異常自身免疫應(yīng)答的外源性因素之間的相互作用而發(fā)病的多因素致病過(guò)程。在特定表觀遺傳因素，遺傳易感性和激素調(diào)節(jié)作用下，觸發(fā)外分泌腺上皮細(xì)胞(SGEC)功能失調(diào)，在pSS的發(fā)病中至關(guān)重要，是T淋巴細(xì)胞、B細(xì)胞過(guò)活躍和自身抗體產(chǎn)生的基礎(chǔ)。既往的研究已將免疫應(yīng)答基因的SNP與pSS易感性聯(lián)系起來(lái)，兩項(xiàng)全基因組關(guān)聯(lián)研究進(jìn)一步證實(shí)了免疫在pSS發(fā)育中的關(guān)鍵作用。但是已鑒定的基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)僅能解釋對(duì)疾病的易感性。因?yàn)榇蠖鄶?shù)都很常見(jiàn)，并且不會(huì)改變編碼的蛋白質(zhì)。且治療手段非常有限，主要以人工唾液、人工淚液改善癥狀為主。

干燥綜合征不僅起病隱蔽病程長(zhǎng),而且發(fā)病的病因病機(jī)尚無(wú)一個(gè)明確的定論,所以對(duì)該病的研究就顯得異常的迫切。建立動(dòng)物模型利用動(dòng)物疾病模型來(lái)研究人類(lèi)疾病，可以克服平時(shí)一些不易見(jiàn)到，而且不便于在病人身上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的各種人類(lèi)疾病的研究。同時(shí)還可克服人類(lèi)疾病發(fā)生發(fā)展緩慢，潛伏期長(zhǎng)，發(fā)病原因多樣，經(jīng)常伴有各種其它疾病等因素的干擾，可以用單一的病因，在短時(shí)間內(nèi)復(fù)制出典型的動(dòng)物疾病模型，對(duì)于研究人類(lèi)各種疾病的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律和防治疾病療效的機(jī)理等是極為重要的手段和工具。但在實(shí)驗(yàn)室中對(duì)動(dòng)物模型的建立又是對(duì)干燥綜合征研究提出的另一個(gè)難題。干燥綜合征的動(dòng)物模型主要是鼠類(lèi),而大鼠的不經(jīng)濟(jì)性，建模成本高，所以小鼠模型較受歡迎。

前期我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)四代有五個(gè)發(fā)病的pSS家系，呈常染色體顯性遺傳。全基因組測(cè)序，經(jīng)過(guò)變體過(guò)濾和分離分析確定為γ-分泌酶激活蛋白基因(GSAP)基因中的p.Pro122Thr是唯一的候選變體。所有受影響的家庭成員均攜帶雜合突變的等位基因，而未受影響的成員具有野生型等位基因，公共變體數(shù)據(jù)庫(kù)中也沒(méi)有該變體。GSAP在阿爾茨海默病中發(fā)揮重要作用，但本家族未發(fā)現(xiàn)阿爾茨海默病病例。我們的研究首次確定了家族性pSS的致病性突變。

綜上所述，現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題是：

目前研究用到的兩種較為普遍的pSS模型為自發(fā)型和誘導(dǎo)型，均存在弊端。自發(fā)型動(dòng)物模型往往是繼發(fā)于另一種疾病而產(chǎn)生SS癥狀，對(duì)于其發(fā)病原因和病理生理機(jī)制的研究無(wú)法深入開(kāi)展。如NOD小鼠常伴發(fā)1型糖尿病。誘導(dǎo)性鼠模型是指通過(guò)對(duì)正常的鼠做出一些相關(guān)的處理以誘導(dǎo)其產(chǎn)生局部的干燥綜合征的癥狀。目前主要使用的誘導(dǎo)方法為注射同種鼠或異種鼠的抗原或組織勻漿進(jìn)行免疫；或用佐劑進(jìn)行免疫；還有通過(guò)接種病毒進(jìn)行誘導(dǎo)。一些誘導(dǎo)型小鼠，如干燥綜合征抗原A誘導(dǎo)的pSS動(dòng)物模型，造模周期較長(zhǎng)，造模過(guò)程煩瑣。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明提供一種基于γ-分泌酶激活蛋白基因的干燥綜合征動(dòng)物模型的建立方法。

技術(shù)方案：為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種基于γ-分泌酶激活蛋白基因的干燥綜合征動(dòng)物模型的建立方法：小鼠Gsap基因位于小鼠5號(hào)染色體上；其中共鑒定出31個(gè)外顯子，ATG起始密碼子位于外顯子1，TGA終止密碼子位于外顯子31；突變位P118位于外顯子5上；外顯子5將被選為目標(biāo)位點(diǎn)；