[發明專利]一種微量精子冷凍保存載體及相應的冷凍和解凍方法

在審

• 申請號: 202110831967.4
• 申請日: 2021-07-22
• 公開（公告）號: CN113491267A
• 公開（公告）日: 2021-10-12
• 發明（設計）人: 張端軍;朱海琴;姚文亮;陳勝輝;張明亮;楊麗娟;李琳;蔣祥龍;彭麗英;劉淑娟;鄭小挺;熊奇;黃玉芳;胡碩楠;孫迎利
• 申請（專利權）人: 南昌市生殖醫院;南昌大學第二附屬醫院
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 深圳紫晴專利代理事務所(普通合伙) 44646
• 代理人: 張歡歡

1.一種微量精子冷凍保存載體，其特征在于，包括：

外套管和蓋子，所述蓋子與所述外套管相適配，所述外套管的上下端面均為貫穿開口；

承載斗，所述承載斗固定安裝在所述外套管內，所述承載斗的底部為尖端狀，所述承載斗的內角為60°；

張力弧片，所述張力弧片固定安裝在所述承載斗內，所述外套管、承載斗和張力弧片均為透明分子制成。

2.根據權利要求1所述的一種微量精子冷凍保存載體，其特征在于，所述外套管以所述承載斗為界限分為存放區和速冷擴展接觸區，所述存放區位于所述速冷擴展接觸區的上方，所述存放區的體積小于所述速冷擴展接觸區的體積，所述存放區的內壁上開設有內螺紋，所述蓋子上開設有外螺紋，所述外螺紋與所述內螺紋相適配。

3.根據權利要求2所述的一種微量精子冷凍保存載體，其特征在于，所述承載斗以所述張力弧片為界限分為液留區和放置區，所述液流區位于所述放置區的上方，所述液流區的體積大于所述放置區的體積，所述液流區與所述存放區相連通。

4.根據權利要求1所述的一種微量精子冷凍保存載體，其特征在于，所述張力弧片的內槽形成張力形成區，所述張力形成區的底部內壁上開設有張力形成口，所述張力形成區與所述液流區相連通，所述張力形成口與所述放置區相連通。

5.根據權利要求1-4任一項所述的一種微量精子冷凍保存載體的冷凍方法，其特征在于，包括以下步驟：

冷凍存放時：待精液液化后進行鏡檢，根據精子的密度確定混合時精液與冷凍保護劑的體積比，精子密度為60×106/ml時精液與冷凍保護劑1：1混合；(20～60)×106/ml時精液與冷凍保護劑2：1混合：20×106/ml時精液與冷凍保護劑4：1混合；

之后緩慢逐滴加入冷凍保護劑，混勻，重新測定每毫升混合液中活動精子的數目，10×106/ml或以上是較為理想的，隨后將數支外套管置于液氮罐中的鋁支架中進行熏凍，使外套管的高度距離液氮液面15～20cm，隨后在外套管的存放區和承載斗內注入足量的冷凍保護劑，用以提高精子存活率，冷凍保護劑的注液高度需高于承載斗的高度，但不得高于存放區的一半，注入冷凍保護劑后迅速使用移液槍或巴斯德槍吸取混合液，之后使槍頭貫穿張力形成口置于放置區內，使混合液置于放置區內即可緩慢抽出并迅速蓋上蓋子，在熏凍時，液氮氣體通過外套管底部的速凍擴展接觸區進入，增大了液氮與外套管和承載斗的接觸面，有利于提高冷凍效率，熏凍時溫度以10℃/min下降，待熏蒸30min后將本裝置迅速置于液氮罐中即可完成操作。

6.根據權利要求5所述的一種微量精子冷凍保存載體的冷凍方法，其特征在于，所述冷凍保護劑選用不含蛋黃的冷凍保護劑，所述不含蛋黃的冷凍保護劑的成分和制備方法如下：蒸餾水850ml、甘油150ml、氯化鈉5.8g、氯化鉀0.4g、乳酸鈣0.76g、硫酸鎂0.12g、磷酸二氫鈉0.05g、碳酸氫鈉2.6g、Hepes4.77g、葡萄糖8.59g、果糖8.59g、甘氨酸10.00g、鏈霉素0.05g、青霉素0.05g和人血清白蛋白4.00g，制備時將上述除甘油和人血清白蛋白之外的其余物質加在一起，搖動使之充分溶解，然后加入人血清白蛋白溶解，最后加入甘油充分混勻，過濾，即可在-20℃下保存。

7.根據權利要求1-4任一項所述的一種微量精子冷凍保存載體的解凍方法，其特征在于，包括如下步驟：

解凍復蘇時，將外套管由液氮罐中取出后，將其放置在37℃的水中采用水浴法進行解凍，解凍后將其置于顯微鏡處，由于外套管、承載斗和張力弧片均為透明分子制成，因此可觀察和控制精子的位置，避免精子丟失，取出的精子迅速放置在培養液中進行培養。