[發(fā)明專利]一種羰基還原酶突變體及其在制備甾體激素--睪酮中的應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202110831411.5
• 申請日: 2021-07-22
• 公開（公告）號: CN113528475A
• 公開（公告）日: 2021-10-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 林娟;蘇冰梅;趙鴻儒;許鑫琦;許煉
• 申請（專利權(quán)）人: 福州大學(xué)
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12P33/18;C12R1/19
• 代理公司: 福州元創(chuàng)專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種羰基還原酶突變體及其在制備甾體激素??睪酮中的應(yīng)用。將羰基還原酶突變體PmCRm與甲酸脫氫酶BstFDH_m在大腸埃希氏菌中共表達，并以該共表達工程菌的靜息細胞作為生物催化劑催化雄甾?4?烯?3，17?二酮合成睪酮。該生物催化劑具有較高的催化活性、區(qū)域選擇性和立體選擇性，可以在10?h以內(nèi)完全轉(zhuǎn)化28.8?g/L雄甾?4?烯?3，17?二酮生成目標產(chǎn)物睪酮，且無副產(chǎn)物產(chǎn)生，其底物投料量、轉(zhuǎn)化率和時空轉(zhuǎn)化率皆為國內(nèi)生物法制備睪酮的最高水平，經(jīng)過分離純化，產(chǎn)物回收率高達95%以上，說明該生物催化劑是睪酮綠色合成的高效催化劑。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種羰基還原酶突變體及其在制備甾體激素--睪酮中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

睪酮（Testosterone，TS）為雄激素類固醇藥物，又稱睪丸素、睪丸酮或睪甾酮，化學(xué)名為17?β-羥基-雄甾-4-烯-3-酮，化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。睪酮在醫(yī)學(xué)上不僅可作為雄性激素藥物用于治療男性原發(fā)性或繼發(fā)性性腺機能減退和維持第二性征和性功能，也可作為關(guān)鍵前體用于一系列高效的類固醇藥物（如甲基睪酮、丙酸諾龍和庚酸睪酮等）的合成。

在傳統(tǒng)方法中，睪酮的制備是通過多步化學(xué)反應(yīng)，將各種原料（茚滿酮、茚二酮、β-谷甾醇、植物甾醇、雄甾-4-烯-3，17-二酮、雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮等）轉(zhuǎn)化為睪酮和反式睪酮的混合物，再通過酶法或者化學(xué)法進行拆分獲得睪酮純品。整個過程涉及3位羰基保護、17位羰基還原、3位去保護及拆分等，過程繁瑣且條件劇烈，污染嚴重，是一種成本高、原子經(jīng)濟性差且回收率低的睪酮合成方法。為了謀求更為環(huán)保、成本更低且操作簡便的睪酮合成方法，科學(xué)家們開始將目光轉(zhuǎn)至生物轉(zhuǎn)化上來并進行了諸多嘗試，以雄甾-4-烯-3，17-二酮或雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮為前體，利用各種微生物（如 Acremonium?strictum、 Beauveria?bassiana和 Cephalosporium?aphidicola等）合成睪酮。但是這種微生物法的產(chǎn)量很低且還含有副產(chǎn)物，難以用于睪酮工業(yè)化生產(chǎn)，所以目前國內(nèi)依然采用化學(xué)法生產(chǎn)睪酮。

2017年，CN?2017-10617905公布了一種利用白色念珠菌 Candida?albicans?7103來源的17β-羥基甾體脫氫酶制備睪酮的酶法工藝，其底物載量達3-5?g/L,?時空轉(zhuǎn)化率達0.397?g/L/h，是國內(nèi)唯一的睪酮酶法制備工藝。羰基還原酶和17β-羥基甾體脫氫酶同屬于短鏈脫氫還原酶家族，皆可催化羰基轉(zhuǎn)化為羥基。且羰基還原酶具有廣闊的底物譜，廣泛應(yīng)用于各種手性醇的工業(yè)化制備中，理論上也能將雄甾-4-烯-3，17-二酮還原為睪酮。但是目前國際上皆未見利用羰基還原酶不對稱還原雄甾-4-烯-3，17-二酮合成睪酮的相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種羰基還原酶突變體及其在制備甾體激素--睪酮中的應(yīng)用。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種羰基還原酶突變體PmCRm，所述突變體是將SEQ?ID?No?.1所示氨基酸序列第136位的亮氨酸突變?yōu)榻z氨酸獲得的。

其中，上述羰基還原酶突變體PmCRm的氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示 。

一種編碼羰基還原酶突變體PmCRm的基因 pmcr_m，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.3所示。