[發(fā)明專利]一種羰基還原酶突變體及其在制備甾體激素--睪酮中的應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110831411.5
• 申請日: 2021-07-22
• 公開（公告）號: CN113528475A
• 公開（公告）日: 2021-10-22
• 發(fā)明（設計）人: 林娟;蘇冰梅;趙鴻儒;許鑫琦;許煉
• 申請（專利權(quán)）人: 福州大學
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12P33/18;C12R1/19
• 代理公司: 福州元創(chuàng)專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

1.一種羰基還原酶突變體PmCRm，其特征在于：所述突變體是將SEQ?ID?No.1所示氨基酸序列第136位的亮氨酸突變?yōu)榻z氨酸獲得的。

2.一種編碼羰基還原酶突變體PmCRm的基因pmcr_m，其特征在于：所述基因核苷酸序列如SEQ?ID?No.3所示。

3.一種重組表達載體，其特征在于：所述重組表達載體包含如權(quán)利要求2所述編碼羰基還原酶突變體PmCRm的基因pmcr_m，且在其下游連有編碼甲酸脫氫酶BstFDH_m的基因bstfdh_m；所述甲酸脫氫酶BstFDH_m的氨基酸序列如SEQ?ID?No.8所示，所述基因bstfdh_m的核苷酸序列如SEQ?ID?No.9所示。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組表達載體，其特征在于：所述重組表達載體為以pET30a為骨架的重組表達載體pET30a-pmcr_m-bstfdh_m。

5.一種共表達工程菌株，其特征在于：所述共表達工程菌株包含如權(quán)利要求4項所述的重組表達載體。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的共表達工程菌株，其特征在于：其為將重組表達載體pET30a-pmcr_m-bstfdh_m轉(zhuǎn)化至宿主微生物中制得的共表達工程菌株；所述的宿主微生物為大腸埃希氏菌E.coli?BL21（DE3）。

7.如權(quán)利要求1所述的羰基還原酶突變體PmCRm在制備甾體激素睪酮中的應用。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應用，其特征在于：將權(quán)利要求4中所述的重組表達載體pET30a-pmcr_m-bstfdh_m轉(zhuǎn)化至E.coli?BL21（DE3）中制得共表達工程菌株，制備共表達工程菌株的靜息細胞的濕菌體；取濕菌體重懸于100?mL磷酸緩沖液中，調(diào)節(jié)濕菌體濃度為100-200?g/L，加入底物雄甾-4-烯-3，17-二酮2.88?g，吐溫80?4?mL，輔底物甲酸鈉1.02?g，NADP⁺?15.7?mg，40℃、230?rpm反應10?h；離心收集反應液中的沉淀，經(jīng)乙醇或乙酸乙酯萃取，減壓濃縮后得睪酮粗品，用水清洗后得睪酮純品。